PVE Branchemethode voor het aantonen van Salmonella met behulp van MSRV in dons, mest en vlees, afkomstig van pluimvee.

Dit protocol beschrijft een methode voor het aantonen van Salmonella in dons, mest en vlees, afkomstig van pluimvee.

De versie van de hier beschreven PVE Branchemethode MSRV is gebaseerd op Annex D va ISO 6579. De wijzigingen in het huidige protocol ten opzichte van de vorige versie (2004) zijn samengevat in hoofdstuk 9.

Salmonella: micro-organismen die de voor deze bacteriën karakteristieke groei vertonen en specifieke biochemische en serologische reacties vertonen wanneer wordt gekweekt respectievelijk getest volgens de beschreven werkwijze.

Na voorincubatie van de te onderzoeken matrix in een voorophopingsmedium, wordt geënt op een half-vast medium, waarna wordt afgestreken op een selectief isolatiemedium, met aansluitend biochemische bevestiging en serotypering.

De samenstelling en bereiding van media en reagentia is opgenomen in bijlage 1. Er mag echter ook gebruik worden gemaakt van media die kant-en-klaar commercieel verkrijgbaar zijn.

Alle gebruikte grondstoffen en het water moeten van analysekwaliteit zijn.

Voor algemene eisen en richtlijnen voor microbiologische onderzoeken wordt verder verwezen naar NEN-EN-ISO 7218:2005 Ontw.

Gebruikelijke apparatuur en glaswerk voor een microbiologisch laboratorium en in het bijzonder de onderstaande:

5.1 Broedstoof voor het bebroeden bij 37 °C ± 1 °C

5.2 Broedstoof voor het bebroeden bij 41, 5 °C ± 1 °C

5.3 Waterbad ingesteld op 47 – 50 °C

5.4 Steriele entnaalden met een oog (öses) van ca 1 µl.

5.5 Steriele pipetten met een schaalverdeling van 0,1 ml en een meetvolume van 1 ml.

5.6 Petrischalen met een middellijn van ca 9 cm.

5.7 Cultuurbuizen van 17/18 x 150 mm en van 8 x 160 mm.

Opmerking:

Gesteriliseerde materialen voor éénmalig gebruik mogen worden toegepast.

Bederfelijke pluimveeproducten zoals borstvellen en filet dienen gekoeld (1-8 °C) te worden aangeleverd. Zie voor de ontvangst van monsters en registratie van afwijkingen bijlage III.

De monsters dienen binnen 4 uur na ontvangst ingezet te worden. Indien de monsters echter binnen 48 uur na monstername op het laboratorium aanwezig zijn, mag gewacht worden met het inzetten van de monsters totdat maximaal 48 uur + 4 uur na het tijdstip van monstername is verstreken.

Stel monsters zo min mogelijk bloot aan temperatuurschommelingen.

Opmerking:

Komen mestmonsters mee met vleesmonsters in een koelbox, sla dan alle monsters gekoeld op. Worden mestmonsters per post ongekoeld verstuurd, sla dan op bij kamertemperatuur, tenzij deze monsters pas de volgende dag worden ingezet.

Voeg zoveel monster toe aan BPw (kamertemperatuur) zodat het monster (minimaal) 1:10 verdund wordt (bijvoorbeeld 25 g monster in 225 ml BPw).

Een ruimere verdunning dan 1:10 is toegestaan, een kleinere verdunning niet.

In Tabel 1 is ter illustratie de relatie tussen de verschillende monsterhoeveelheden en het volume BPw weergegeven:

Ter uitvoering van Verordening (EG) nr. 2160/2003 is in Verordening (EG) nr. 1003/2005 aangegeven dat de monsters van vermeerderingskoppels van Gallus gallus als volgt behandeld dienen te worden:

Inlegvellen van uitkomstladen:

– Plaats de inlegvellen in 1 liter BPw (kamertemperatuur) en schud voorzichtig. Volg verder de procedure vanaf 6.3.

Overschoentjes:

1. –

   Pak het paar overschoentjes zorgvuldig uit om te vermijden dat aanhangend fecaal materiaal loskomt en plaats ze in 225 ml BPw (kamertemperatuur);

2. –

   Bij samenvoegen van vijf paar overschoentjes tot twee monsters: breng vijf afzonderlijke monsters in minimaal 225 ml BPw en zorg ervoor dat alle monsters volledig ondergedompeld zijn;

3. –

   Zwenk om, zodat het monster volledig verzadigd is, en volg verder de procedure vanaf 6.3.

Andere feces (mest) monsters:

1. –

   Breng in het laboratorium elk monster (of verzamelmonster) over in een even groot gewicht BPw en schud voorzichtig;

2. –

   Laat het monster 10-15 min zacht worden en schud voorzichtig;

3. –

   Neem onmiddellijk na het mengen 50 g van het mengsel en voeg dat bij 200 ml BPw (kamertemperatuur). Volg verder de procedure vanaf 6.3.

Opmerking:

Belangrijk is dat de overschoentjes minimaal 1:10 verdund worden in BPw. Bij 1 paar overschoentjes kan 225 ml BPw een grote overmaat zijn. Het is eventueel mogelijk om het paar overschoentjes te wegen en vervolgens zoveel BPw toe te voegen dat de overschoentjes minimaal 1:10 verdund zijn. Bijvoorbeeld als 2 paar overschoentjes 10 g weegt volstaat het om 90 ml BPw toe te voegen (zorg wel dat de monsters volledig ondergedompeld zijn).

Incubeer de BPw 18 uur ± 2 uur bij 37 °C ± 1 °C.

In uitzonderlijke gevallen kan de BPw na incubatie maximaal 2 dagen bewaard worden bij 5 °C ± 3 °C.

Breng 0,1 ml BPw-cultuur op een MSRV plaat (9 cm) door 3 druppels, met een gezamenlijk volume van 0,1 ml, in een driehoek op de MSRV aan te brengen. Incubeer de platen 24 uur ± 3 uur bij 41, 5 °C ± 1 °C.De platen moeten met het deksel van de Petrischaal naar boven geïncubeerd worden, aangezien het een half-vast medium is. Niet verdachte of negatieve platen dienen nogmaals 24 uur ± 3 uur bij 41,5 °C ± 1 °C bebroed te worden.

Een verdachte MSRV-plaat vertoont groei in de agar (zwerming vanuit de entingsplaats) en heeft een wit/grijze kleur.

Verdachte MSRV platen worden afgeënt door aan de rand van de zwermzone met een (1 µl) öse materiaal uit de agar te nemen en daarmee een gedroogde XLD plaat te beënten.

Incubeer de XLD platen gedurende 24 uur ± 3 uur bij 37 °C ± 1 °C.

De meeste Salmonella stammen zijn lactose-negatief en HIS-positief en zijn op Xt-D te herkennen als roze kolonies met een zwart centrum (vaak helemaal zwart). Lactosenegatieve en H₂S-negatieve stammen vormen alleen roze kolonies (zonder zwarting).

Beschouw daarom alle roze kolonies, met en zonder zwart centrum, als verdacht voor Salmonella.

Er zijn ook lactose-positieve en H₂S-positieve Salmonella stammen die op XLD gele kolonies met een zwart centrum vormen en lactose-positieve en H₂S-negatieve stammen die helemaal geel zijn. Deze laatste twee groepen (met gele kolonies) komen bij pluimvee zelden voor.

Voer de bevestiging uit met minimaal 1 tot maximaal 3 specifieke kolonies per plaat in geval van reincultuur en tot 5 specifieke kolonies (indien aanwezig) in geval van mengcultuur totdat een positief resultaat wordt verkregen. De kolonies worden vanaf de XI-D plaat geënt in UA middels het afstrijken op het oppervlak van de agar en in TSI middels ladderen over het schuin gestolde oppervlak en een steekenting tot op de bodem van de buis. Beënt tevens een buis LDC door een hoeveelheid koloniemateriaal tegen de wand van de buis net onder het vloeistofoppervlak af te strijken. De buizen worden 24 uur ± 3 uur bij 37 °C ± 1 °C geïncubeerd.

Opmerking:

Wanneer geen goed losliggende kolonies op de XLD plaat zijn verkregen, of bij de aanwezigheid van veel spreidende of overgroeiende stoorflora, is het nodig ter zuivering een nieuwe reinstrijk op een gedroogde XLD- of nutriëntenagarplaat te maken. Bij verontreiniging van de Salmonella-kolonie met andere bacteriën wordt een afwijkend biochemisch patroon verkregen. Het is toegestaan om eerst de bevestigingstest met de TSI uit te voeren, en bij een verdachte uitslag door te gaan met ureum en LDC.

Na incubatie geven voor Salmonella verdachte kolonies de volgende biochemische resultaten:

Het gebruik van biochemische kits (zoals bijvoorbeeld API of BBI- Crystal) is ook toegestaan.

Alle biochemisch verdachte kolonies dienen geserotypeerd te worden volgens het Kauffmann-White schema. Een toelichting op de serotypering van 6 veel voorkomende Salmonella serotypes is beschreven in PVE-SALMONELLA-SERO-140607.

Voor de eerstelijnscontrole van de methode dienen te worden meegenomen:

1. –

   Blanco controle,

2. –

   Negatieve controle (indien een ingangscontrole per batch wordt toegepast, kan deze negatieve controle komen te vervallen),

3. –

   Positieve controle.

De kwaliteitscontrole per batch MSRV is beschreven in bijlage 2.

Geef het resultaat op als ‘Salmonella aangetoond / niet aangetoond in het betreffende monstermateriaal’ als Salmonella al dan niet is aangetoond volgens dit protocol. Bij de uitslag kan tussen haakjes aangegeven worden hoeveel gram monstermateriaal is onderzocht.

Indien bij het aanleveren van de monsters afwijkingen worden geconstateerd van de wijze waarop de monsters aangeleverd moeten worden (zie bijlage III) dan dient het laboratorium op het analysecertificaat hierover een opmerking te maken en de eventuele gevolgen voor de betrouwbaarheid van de uitslag aan te geven.

De huidige versie van de PVE Branchemethode MSRV is gebaseerd op Annex D van ISO 6579. Om de PVE branchemethode zoveel mogelijk gelijk te trekken met Annex D van ISO 6579 zijn de volgende wijzigingen ten opzichte van het vorige protocol (2004) doorgevoerd:

1. –

   De concentratie novobiocine in het selectieve ophopingsmedium MSRV is gewijzigd in 10 mg/L (was 20 mg/L);

2. –

   De pH eis van MSRV bij kamertemperatuur is 5,2 gebleven, echter de range is 5,1 - 5,4 geworden (in plaats van 5,2 ± 0,2);

3. –

   De incubatietemperatuur van MSRV is gewijzigd in 41, 5 °C ± 1 °C (was 42 °C ± 0, 5 °C);

4. –

   Het uitplaatmedium is gewijzigd in Xylose Lysine Desoxycholaat (XLD) agar (was Briljantgroen agar: BGA). Voor het uitplaten kan worden volstaan met standaard formaat Petrischalen met XLD (ca 9 cm diameter).

Met deze wijzigingen is de PVE branchemethode MSRV zoveel mogelijk gelijk gemaakt aan Annex D van ISO 6579. Echter op een tweetal aspecten verschilt de PVE branchemethode nog met Annex D:

1. –

   Annex D schrijft voor dat het uitplaten vanaf MSRV dient te geschieden op XLD en op een tweede selectieve agarplaat naar keuze. In de PVE branchemethode is alleen XLD als uitplaatmedium aangegeven. Dit is in lijn met de vorige versie(s) van de PVE branchemethode MSRV waarin ook slechts één uitplaatmedium werd voorgeschreven, zijnde BGA. Uit literatuur blijkt dat XLD een hoge sensitiviteit en specificiteit heeft (Cooke et al., 1999) en in sommige pluimveemonsters een hoger percentage positiviteit vertoont dan BGA (Rall et al., 2005). De belangrijkste Salmonella serotypes die bij pluimvee worden gevonden groeien op XLD (Feldsine et al., 2003), zodat verwacht mag worden dat een tweede uitplaatmedium naast XLD weinig extra informatie toevoegt.

2. –

   De biochemische bevestiging zoals beschreven in Annex D is uitgebreider dan die van de PVE branchemethode. Echter, de in de PVE branchemethode beschreven bevestigings testen zijn reeds voldoende om de meerderheid van de Salmonella verdachte kolonies op XLD als biochemisch verdacht te kenmerken. Na de biochemische bevestiging vindt ook nog een serotypering plaats wat uiteindelijk de definitieve uitslag voor Salmonella geeft.

1. •

   Cooke, V.M., R.J. Miles, R.G. Price and A.C. Richardson, 1999. A novel chromogenic ester agar medium for detection of Salmonellae. Applied and Environmental Microbiology, 1999, Vol. 65, no 2, p 807-812.

2. •

   Feldsine, P.T., Lienau, A.H., Leung, S.C., Mui, L.A., Humbert, F., Bohnert, M., Mooijman, K., Schulten, S, in ’t Veld, P., Rollier, P., Leuschner, R and Capps, K., 2003. Detection of Salmonella in fresh cheese, poultry products, and dried egg products by the ISO 6579 Salmonella culture procedure and the AOAC official method: Collaborative study. Journal of AOAC International, vol 86, no. 2, 2003, 275-295.

3. •

   Hartman, dr. E.G., 1999. Validatierapport van de isolatie van Salmonella uit de matrix pluimvee faeces m.b.v. het Modified Semi-solid Rappaport Vassiliadis (MSRV) medium. Gezondheidsdienst voor dieren, GD projectnummer 401909, rapport nr. 1, september 1999.

4. •

   ISO 6579:2002 / Amendment 1:2007. Annex D: Detection of Salmonella spp. in animal faeces and in environmental samples from the primary production stage. International Standardisation Organisation, Geneva, Switzerland.

5. •

   PVE-SALMONELLA-SERO-140607. Toelichting op de serotypering van Salmonella volgens het Kauffmann-White schema. Productschap Vee, Vlees en Eieren, Zoetermeer. www.pve.nl

6. •

   NEN-EN-ISO 6579:2002. Microbiologie van voedingsmiddelen en diervoeders – Horizontale methode voor het aantonen van Salmonella spp. Nederlands Normalisatie Instituut, Delft.

7. •

   NEN-EN-ISO 7218:2005 Ontw. En. Microbiologie van voedingsmiddelen en diervoeders – Algemene eisen en richtlijn voor microbiologische onderzoeken. Nederlands Normalisatie Instituut, Delft.

8. •

   Rall, V.L.M., R. Rall, L. Casale Aragon and M. Guimaraes da Silva, 2005. Evaluation of three enrichment broths and five plating media for Salmonella detection in poultry. Brazilian Journal of Microbiology, 2005, 36: 147-150.

9. •

   Verordening (EG) nr. 1003/2005 ter uitvoering van Verordening (EG) nr. 2160/2003 van het Europees Parlement en de Raad wat betreft een communautaire doelstelling voor het verminderen van de prevalentie van bepaalde serotypen Salmonella bij vermeerderingskoppels van Gallus gallus en tot wijziging van Verordening (EG) nr. 2160/2003. Publicatieblad van de Europese Unie, L 170/12, 01072005.

10. •

    Zee, van der H., E. De Boer, P. Van Netten, 1990. Salmonella isolatie met behulp van MSRV. De Ware (n) chemicus 20: 189-199.

Samenstelling:

Bereiding:

1. –

   Los de ingrediënten op in het water (indien nodig d.m.v. verhitting);

2. –

   Indien nodig, stel de pH, zodat deze na sterilisatie 7,2 ± 0,2 bij 25°C bedraagt;

3. –

   Verdeel het medium over daarvoor geschikte flessen of potten;

4. –

   Steriliseer in een autoclaaf ( 15 min. 121°C).

Oplossing A (basis):

Bereiding

1. –

   Los de ingrediënten op in het water;

2. –

   Breng het mengsel onder voortdurend mengen aan de kook (verhit niet te lang!);

3. –

   NIET AUTOCLAVEREN;

4. –

   Indien nodig, stel de pH, zodat deze na verhitten 5,2 (5,1 - 5,4) bij 25 °C bedraagt;

5. –

   Koel het mengsel af tot 47 - 50 °C.

Oplossing B (novobiocine):

1. –

   Los 0,05 g novobiocine op in 10 ml water;

2. –

   Steriliseer de oplossing d.m.v. filtratie (filter met poriegrootte van 0,22 µm).

3. –

   Indien de oplossing niet direct wordt gebruikt kan deze opgeslagen worden bij 5 °C ± 3 °C voor maximaal 4 weken, of bij -20 °C ± 5 °C voor maximaal 1 jaar.

Bereiding MSRV medium:

1. –

   Voeg 2 ml van oplossing B aseptisch toe aan oplossing A (1000 ml), bij 47 - 50 °C;

2. –

   Meng de oplossing voorzichtig;

3. –

   De eind pH dient 5,2 (5,1 - 5,4) bij 25 °C te zijn;

4. –

   Giet uit in Petrischalen (15-20 ml in Petrischalen met een diameter van 9 cm);

5. –

   Laat het medium stollen en behandel de platen voorzichtig;

6. –

   Bewaar de platen, rechtop, bij 5 °C ± 3 °C (in het donker) voor maximaal 2 weken;

7. –

   Keer de platen niet om, de agar is hiervoor te slap;

8. –

   Indien nodig, droog de platen vlak voor gebruik, bijvoorbeeld door ze rechtop zonder deksel in een Laminar Air Flow kabinet te plaatsen.

Samenstelling

Bereiding:

1. –

   Los de ingrediënten op in het water en breng het mengsel onder voortdurend mengen aan de kook en verhit tot de agar is opgelost (verhit niet te lang!);

2. –

   NIET AUTOCLAVEREN;

3. –

   Indien nodig, stel de pH, zodat deze na verhitten 7,4 ± 0,2 bij 25 °C bedraagt;

4. –

   Koel het mengsel af tot 47-50 °C en giet vervolgens uit in Petrischalen (15-20 ml in Petrischalen met een diameter van 9 cm);

5. –

   Laat het medium stollen;

6. –

   Bewaar de platen bij 5 °C ± 3 °C voor maximaal 5 dagen;

7. –

   Indien nodig, droog de platen voor gebruik.

Oplossing A (basismedium):

Bereiding:

1. –

   Los de ingrediënten op in het water (indien nodig middels verhitten);

2. –

   Indien nodig, stel de pH, zodat deze na sterilisatie 6,8 ± 0,2 bij 25 °C bedraagt;

3. –

   Steriliseer de oplossing gedurende 15 min bij 121°C in een autoclaaf;

4. –

   Laat de oplossing afkoelen tot 47-50 °C.

Oplossing B (ureumoplossing):

Bereiding:

1. –

   Los de ureum op in het water;

2. –

   Steriliseer de oplossing d.m.v. filtratie (filter met poriegrootte van 0,22 µm).

Samenstelling compleet medium:

Bereiding:

1. –

   Voeg oplossing B (ureumoplossing) aseptisch toe aan oplossing A (basismedium) 50°C;

2. –

   Verdeel het medium over steriele buizen, per buis 10 ml medium;

3. –

   Laat de buizen stollen zodat een schuin gedeelte ontstaat.

Samenstelling:

Bereiding:

1. –

   Los de ingrediënten op in het water (indien nodig d.m.v. verhitting);

2. –

   Indien nodig, stel de pH, zodat deze na sterilisatie 7,4 ± 0,2 bij 25°C bedraagt;

3. –

   Verdeel het medium over buizen, per buis 10 ml medium;

4. –

   Steriliseer de oplossing gedurende 15 min bij 121°C in een autoclaaf;

5. –

   Laat de buizen stollen zodat er bovenop 2, 5 cm agar onderin de buis, een schuin gedeelte ontstaat.

Samenstelling:

Bereiding:

1. –

   Los de ingrediënten op in het water (indien nodig d.m.v. verhitting);

2. –

   Indien nodig, stel de pH, zodat deze na sterilisatie 6,8 ± 0,2 bij 25 °C bedraagt;

3. –

   Verdeel het medium over smalle reageerbuizen; per buis 5 ml medium;

4. –

   Steriliseer gedurende 15 min bij 121°C in een autoclaaf.

Onderwerp

Deze bijlage beschrijft een methode voor de kwaliteitscontrole van batches MSRV.

Volg onderstaand schema voor de kwaliteitscontrole per batch MSRV.

Inoculum: Kolonie aanstippen met een entoogje en afstrijken langs de wand van een buisje met (10 ml) gebufferd peptonwater (BPw). Incubeer 18 uur ± 2 uur bij 37 °C ± 1 °C. De cultuur zal in BPw uitgroeien tot circa 108 cfu/ml. Maak verdunningen in BPw tot circa 103 cfu/ml.

Als negatieve controle kan een Escherichia coli stam gebruikt worden.

Kweek de stam op zoals beschreven voor de positieve controle. Maak verdunningen in BPw tot 10⁵ – 10⁶ cfu/ml.

Volg de procedure zoals beschreven voor de positieve controle.

E. coli dient geen zwerming te vertonen op MSRV.

Opmerking:

Controlestammen zijn onder andere verkrijgbaar bij de VWA in Groningen (www.vwa.nl/chek).

Toelichting op de serotypering van Salmonella volgens het Kauffmann-White schema.

Voor de serotypering van Salmonella spp. volgens het Kauffmann-White schema (Popoff, 2001) worden door diverse fabrikanten verschillende voorschriften geleverd.

Voor de juiste wijze van typeren dient dan ook altijd het voorschrift van de fabrikant gevolgd te worden.

Details over de taxonomie van Salmonella alsmede over de antigene formules van de Salmonella serotypen staan beschreven in Popoff (2001 ). Onderstaande informatie is een korte toelichting hierop.

De serotypering van Salmonella spp. bestaat uit de volgende stappen:

1. –

   Selectie van een Salmonella verdachte kolonie (vastgesteld middels biochemische typering);

2. –

   Onderzoek naar auto-agglutinatie;

3. –

   Agglutinatie met O-antisera: voor het aantonen van O-antigenen in het Lipopolysaccharide (LPS) van de bacterie;

4. –

   Agglutinatie met H-antisera: voor het aantonen van de H-antigenen in de flagellen van de bacterie.

In het onderstaande stuk wordt de procedure beschreven voor het serotyperen van 6 Salmonella serotypes welke momenteel (2007) regelmatig bij pluimvee worden aangetroffen (zie ook bijlage 1). Deze 6 Salmonella serotypes betreffen:

Salmonella Typhimurium (1, 4, [5], 12 : i : 1, 2)

Salmonella Paratyphi B var. Java (1, 4, [51, 12 : b : 1, 2)

Salmonella Enteritidis (1, 9, 12 : g, m : -)

Salmonella Infantis (6, 7, 14 : r : 1,5)

Salmonella Virchow (6, 7, 14 : r : .1,2)

Salmonella Hadar (6, 8 : zlo : e, n, x)

Kweek een reincultuur van een kolonie welke middels biochemische typering als verdacht voor Salmonella kan worden beschouwd. Gebruik de kweekmethode en het medium zoals voorgeschreven door de fabrikant.

Voer het onderzoek naar auto-agglutinatie uit volgens het voorschrift van de fabrikant. De wijze van onderzoek naar auto-agglutinatie alsmede het aflezen geschiedt op gelijke wijze als de agglutinatie met O-antisera (zie ook 4. Agglutinatie met O-antisera).

Een voorbeeld voor onderzoek naar auto-agglutinatie is hieronder beschreven.

Breng op een objectglas een druppel zoutoplossing (0,85% NaCl);

Breng met een steriele entnaald bacteriemateriaal in de druppel zodat een lichte melkachtige suspensie wordt verkregen;

Beweeg het objectglas heen-en-weer (druppel laten zwenken). De tijd van zwenken varieert per fabrikant van 5 sec tot 60 sec;

Beoordeel de suspensie. De aanwezigheid van klontjes in het preparaat duidt op autoagglutinatie van de onderzochte stam. De stammen die auto-agglutinatie vertonen kunnen niet verder onderzocht worden voor serotypering.

Controleer voor gebruik of de antisera (O en H) helder zijn. Indien troebeling zichtbaar is volg dan de aanwijzingen van de fabrikant.

Opmerking: Bewaar goed getypeerde Salmonella stammen van ringonderzoeken om antisera te testen.

Voor het aantonen van de 6 bovengenoemde Salmonella serotypes worden de volgende O-antisera gebruikt (in volgorde van de hierboven genoemde serotypes):

Begin de agglutinatie met O:4 antiserum. Levert dit een negatief resultaat op, test dan met O:9 antiserum. Levert dit ook een negatief resultaat op test dan met O:7 antiserum. Levert dit ook een negatief resultaat op test dan met O:8 antiserum.

Volg voor de uitvoering en het aflezen van de agglutinatiereactie strikt het voorschrift van de fabrikant.

Een aantal fabrikanten gebruikt een objectglas methode voor het agglutineren. Daarbij wordt een druppel antiserum gemengd met bacteriemateriaal (direct vanaf plaat of vanuit een bacteriesuspensie) op het objectglas, zodanig dat een lichte melkachtige suspensie wordt verkregen. Het objectglas wordt vervolgens heen-en-weer bewogen (druppel laten zwenken).

Vervolgens wordt de reactie afgelezen. De aanwezigheid van klontjes in het preparaat duidt op een positieve reactie. Per fabrikant kunnen o.a. de volgende zaken verschillen:

1. –

   Grootte van de druppel op het objectglas (bijv. ‘25 µl’ of ‘een druppel’);

2. –

   Wijze van opbrengen van antiserum en bacteriemateriaal op het objectglas (bacteriemateriaal direct vanaf agar of via een suspensie toevoegen aan een druppel antiserum op het objectglas of antiserum toevoegen aan een druppel ‘bacteriesuspensie’, op het objectglas);

3. –

   Zwenktijd van het objectglas (kan variëren van 5 sec tot 60 sec);

4. –

   Wijze van aflezen van het resultaat (met blote oog, met vergrootglas, tegen een donkere achtergrond, etc.);

5. –

   Interpretatie van de resultaten (lees met name de voetnoten m.b.t. de beperkingen) .

Na het agglutineren met O-antisera, vindt de agglutinatie met H-antisera plaats.

Salmonella bezit vaak twee typen H-antigeen (fase 1 en fase 2). Indien bij difasische stammen één H-fase negatief wordt gevonden, dient de tweede fase aangetoond te worden middels een fase-inversie methode. Bij fase-inversie wordt het dominante H-antigeen onderdrukt zodat het 2e H-antigeen tot expressie kan komen en kan worden aangetoond.

Het medium dat hiervoor gebruikt wordt dient zodanig te zijn dat Salmonella hier goed in kan bewegen. Een voorbeeld van een dergelijk ‘zwerm medium’ is Sven Gard agar.

Een voorbeeld van een fase inversie methode wordt onder 6. beschreven.

Volg voor zowel het opkweken van de stam als voor het uitvoeren en het aflezen van de agglutinatiereactie met H-antiserum de voorschriften van de fabrikant.

Gebruik de volgende H-antisera voor het aantonen van de 6 hierboven genoemde Salmonella serotypes.

Agglutineer met H:i én H:2 antisera. Indien beiden een positief resultaat opleveren dan is de uitslag: Salmonella Typhimurium.

Voor Salmonella Paratyphi B var. Java dient de agglutinatie met H:b én H:2 antisera positief te zijn.

Test met H:G(complex) antiserum. Indien dit een positief resultaat oplevert, test dan vervolgens met H:m antiserum. Indien dit ook een positief resultaat oplevert voer dan een negatieve controle uit op H:g, H:s en H:t antisera. Indien het resultaat als volgt is:

H:G : + , H:m : + , H:g : -, H:s : - en H:t : -, test dan met 0:46 of met O:12 (O:2,12 of O:4, 12) . Indien vervolgens de agglutinatie met O :46 negatief is, of de agglutinatie met O: 12 positief is, dan is de uitslag: Salmonella Enteritidis.

N.b.: Let op bij de aanschaf van H:G(complex) antiserum dat onderscheid gemaakt kan worden tussen H:g,m en H:m,t. Bijvoorbeeld: met H:g,p antiserum kan onderscheid gemaakt worden tussen H:g,m en H:m,t. Echter met een H:g,m antiserum kan dit onderscheid niet gemaakt worden. Bovendien kan met een H:g,m antiserum geen H:g aangetoond worden bij H:g,m stammen. Dit kan wel met H:g,p antiserum.

Agglutineer met H:r én H:2 én H: 5 antisera.

Indien H:r én H: 5 positief zijn dan is de uitslag: Salmonella Infantis.

Indien H:r én H: 2 positief zijn dan is de uitslag: Salmonella Virchow.

Agglutineer met H:z₁₀ én H:x antisera. Indien beiden positief zijn agglutineer dan vervolgens met O:6,7 of met O:6₁ antiserum. Indien ook O:6,7 of O:6₁ een positief resultaat oplevert dan is de uitslag: Salmonella Hadar.

N.b.: Let op bij de aanschaf van O:6, 7 antiserum dat dit antiserum ook goed reageert met O:6,8 stam en (informeer bij de fabrikant).

Het hieronder beschreven voorbeeld voor een fase inversie methode betreft de serotypering van Salmonella Typhimurium. In zijn algemeenheid is de methode ook toepasbaar voor andere Salmonella serotypes.

Indien O:4 en H:i positief zijn en H:2 negatief, handel dan als volgt:

Bereid een agarplaat met anti-H:i (bijvoorbeeld Sven Gard serum-mix welke H:i bevat). Ent de stam op het centrum van deze plaat (volg voorschrift van de fabrikant). Agglutineer na incubatie met H:2. Indien dit opnieuw een negatief resultaat oplevert, agglutineer dan opnieuw met H:i. Indien H:i een negatieve of zwakke agglutinatie vertoont dan is het resultaat geen Salmonella Typhimurium. Indien H:i wel een positieve (sterke) agglutinatie vertoont voer dan een tweede fase inversie uit. Bereid hiertoe opnieuw een agarplaat met anti-H:i. Neem bacteriemateriaal van de buitenrand van de eerste fase inversie plaat voor het beënten van de tweede fase inversie plaat. Herhaal de procedure zoals hierboven beschreven.

• Popoff, M.Y, 2001. Antigenic formulas of the Salmonella serovars. WHO Collaborating Centre for Reference and Research on Salmonella. Institute Pasteur, Paris, France.

PVE Branchemethode voor het aantonen van Salmonella met behulp van VIDAS SLM in dons, afkomstig van pluimvee.

Dit protocol beschrijft een 48-uurs methode voor het aantonen van Salmonella met behulp van de VIDAS SLM test (bio Mérieux) in dons afkomstig van pluimvee.

Salmonella: alle typen Salmonella waarvan zowel O als H antigenen met behulp van de Enzyme Linked Fluorescent Assay (ELFA) techniek worden aangetoond, wanneer wordt getest volgens de beschreven werkwijze.

VIDAS SLM is een enzym immunoassay voor detectie van Salmonella antigenen, waarbij gebruik wordt gemaakt van de ELFA methode en geautomatiseerd uitgevoerd op het VIDAS analyse apparaat.

De voorophoping en de selectieve ophopingen vinden achtereenvolgens plaats gedurende 18 uur in een voorophopingsmedium, 6-8 uur in 2 verschillende selectieve ophopingsmedia en als laatste gedurende 18 uur in een 3^e ophopingsmedium. Van dit laatste ophopingsmedium wordt een hoeveelheid verhit en in een reagens strip gebracht. De reagens strip wordt in het VIDAS analyse apparaat gebracht, waarna het aantonen van aanwezigheid van Salmonella antigenen met behulp van een cocktail van specifieke monoclonale antilichamen en een fluorescentie reactie volledig geautomatiseerd verloopt. Het test resultaat van deze aantoningsstap is na ca. 45 minuten beschikbaar.

Alle gebruikte grondstoffen en het water moeten van analysekwaliteit zijn.

De samenstelling en bereiding van media en reagentia is opgenomen in bijlage 1 van PVE-SALMONELLA-MSRV-140607 dan wel NEN-EN-ISO 6579: 2002. Er mag echter ook gebruik worden gemaakt van media die kant-en-klaar commercieel verkrijgbaar zijn.

De VIDAS SLM test bestaat uit kant-en-klare reagentia, zoals omschreven in de gebruiksaanwijzing van de VIDAS SLM 30 702 test, instructie van de fabrikant.

Voor algemene eisen en richtlijnen voor microbiologische onderzoeken wordt verder verwezen naar NEN-EN-ISO 7218:2005 Ontw.

De gebruikelijke apparatuur voor een microbiologisch laboratorium en de voor de VIDAS SLM test benodigde apparatuur, zoals onderstaand vermeld:

5.11 Broedstoof voor het bebroeden bij 37°C ± 1 °C

5.12 Broedstoof voor het bebroeden bij 41,5°C ± 1 °C

5.13 Micropipet (500 µl)

5.14 Steriele micropipetpunten

5.15 Waterbad (95-100 °C) of equivalent

5.16 Steriele entnaalden met een oog met een diameter van ca. 3 mm

5.17 Steriele pipetten met een schaalverdeling van 0,1 ml en een meetvolume van 1 ml

5.18 Petrischalen met een middellijn van ca. 9 cm

5.1 9 Cultuurbuizen van 17/18 x 150 mm en van 8 x 160 mm

5.20 Stomacherzakken (met filter)

5.21 VIDAS analyse apparaat

Opmerking:

Gesteriliseerde materialen voor éénmalig gebruik mogen worden toegepast.

Zie voor de acceptatie criteria voor monstermateriaal bijlage III.

De monsters dienen binnen 4 uur na ontvangst ingezet te worden. Indien de monsters echter binnen 48 uur na monstername op het laboratorium aanwezig zijn, mag gewacht worden met het inzetten van de monsters totdat maximaal 48 uur + 4 uur na het tijdstip van monstername is verstreken.

Verdun het monster 1 : 10 in BPw (25 gram dons in 225 ml BPw).

Stomacher, en incubeer de BPw 18 uur ± 2 uur bij 37 °C ± 1°C.

Breng na incubatie van de BPw 1 ml van deze suspensie over in 10 ml MKTTn bouillon.

Incubeer 6-8 uur bij 37°C ± 1°C.

Breng tegelijkertijd ook 0,1 ml van deze BPw suspensie over in 10 ml RVS bouillon. Incubeer 6-8 uur bij 41,5°C ± 1°C.

Breng na incubatie van de MKTTn bouillon 0,1 ml hiervan over in 10 ml M bouillon. Breng na incubatie van de RVS bouillon 1 ml hiervan over in een 2e buis met 10 ml M bouillon. Herincubeer de MKTTn bouillon en de RVS bouillon voor nog eens 16-20 uur, om bevestiging achteraf mogelijk te maken.

Incubeer de M bouillon buizen gedurende 16-20 uur bij 41,5°C ± 1°C.

Meng de M bouillon buizen na incubatie en breng uit elke buis 1 ml over in 1 gezamenlijk eppendorfbuisje. Sluit het buisje en verhit gedurende 15 ± 1 minuten in een waterbad van 95-100°C. Voer vervolgens de VIDAS SLM test uit volgens de gebruiksaanwijzing van de fabrikant.

Bewaar de overgebleven bouillons bij 2-8°C voor eventuele bevestiging.

Resultaten worden beoordeeld zoals omschreven in het voorschrift van de fabrikant (gebruiksaanwijzing VIDAS SLM 30 702 test). Deze zijn gebaseerd op metingen van de fluorescentie en worden gestandaardiseerd naar de zgn. Test Value. Resultaten met een Test Value onder de 0,23 betreffen monsters waarin Salmonella antigenen niet aantoonbaar waren. Resultaten met een test Value > / = 0,23 worden als Salmonella-positief gerapporteerd. Positieve resultaten moeten worden bevestigd met behulp van de bewaarde ophopings- en na-ophopingsmedia.

Ent met een öse vanuit de ophopingsbouillons (MKTTn en RVS) en vanuit de koel bewaarde M bouillons af op gedroogde XLD platen. Incubeer deze platen gedurende 24 uur ± 3 uur bij 37°C ± 1 °C.

De meeste Salmonella stammen zijn lactose-negatief en H₂S-positief en zijn op XLD te herkennen als roze kolonies met een zwart centrum (vaak helemaal zwart). Lactosenegatieve en H₂S-negatieve stammen vormen alleen roze kolonies (zonder zwarting).

Beschouw daarom alle roze kolonies, met en zonder zwart centrum, als verdacht voor Salmonella.

Er zijn ook lactose-positieve en H₂S-positieve Salmonella stammen die op XLD gele kolonies met een zwart centrum vormen en lactose-positieve en H₂S-negatieve stammen die helemaal geel zijn. Deze laatste twee groepen (met gele kolonies) komen bij pluimvee zelden voor.

Bevestiging van verdachte kolonies, zowel biochemisch als serologisch, vindt vervolgens plaats zoals omschreven in PVE-SALMONELLA-MSRV-140607 en PVE-SALMONELLA-SERO-140607.

De VIDAS SLM test kit bevat een positieve en een negatieve VIDAS reagens controle en een bijbehorende standaard. Deze worden meegenomen in de bepalingen zoals omschreven in de gebruiksaanwijzing van de VIDAS SLM test, instructie van de fabrikant.

Voor de eerstelijnscontrole van de methode dienen te worden meegenomen:

1. –

   Blanco controle,

2. –

   Negatieve controle (indien een ingangscontrole per batch wordt toegepast, kan deze negatieve controle komen te vervallen),

3. –

   Positieve controle.

Geef het resultaat op als ‘Salmonella aangetoond / niet aangetoond in het betreffende monstermateriaal’ als Salmonella al dan niet is aangetoond volgens dit protocol. Bij de uitslag kan tussen haakjes aangegeven worden hoeveel gram monstermateriaal is onderzocht.

Indien bij het aanleveren van de monsters afwijkingen worden geconstateerd van de wijze waarop de monsters aangeleverd moeten worden (zie bijlage III) dan dient het laboratorium op het analysecertificaat hierover een opmerking te maken en de eventuele gevolgen voor de betrouwbaarheid van de uitslag aan te geven.

1. •

   Gebruiksaanwijzing VIDAS SLM 30 702 test, instructie van de fabrikant.

2. •

   Hartman, E.G., Validatierapport van de isolatie van Salmonella uit de matrix pluimvee faeces m.b.v. het Modified Semi-solid Rappaport Vassiliadis (MSRV)-medium, Gezondheidsdienst voor Dieren, projectnr. 401919, september 1999.

3. •

   NEN-EN-ISO 6579:2002. Microbiologie van voedingsmiddelen en diervoeders – Horizontale methode voor het aantonen van Salmonella spp. Nederlands Normalisatie Instituut, Delft.

4. •

   NEN-EN-ISO 7218:2005 Ontw. En. Microbiologie van voedingsmiddelen en diervoeders – Algemene eisen en richtlijn voor microbiologische onderzoeken. Nederlands Normalisatie Instituut, Delft.

5. •

   PVE-SALMONELLA-MSRV-140607. PVE Branchemethode voor het aantonen van Salmonella met behulp van MSRV in dons, mest en vlees, afkomstig van pluimvee.

6. •

   Productschap Vee, Vlees en Eieren, Zoetermeer. www.pve.nl PVE-SALMONELLA-SERO-140607. Toelichting op de serotypering van Salmonella volgens het Kauffmann-White schema. Productschap Vee, Vlees en Eieren, Zoetermeer. www.pve.nl bol

7. •

   Van der Zee, H. et al. Validatierapport van de Salmonella bepaling in de matrix dons met behulp van de VIDAS SLM methode. PVE, september 2002.

PVE Branchemethode voor het aantonen van Salmonella met behulp van iQ Check^TM realtime PCR in dons, mest en vlees, afkomstig van pluimvee.

Dit protocol beschrijft een 24-uurs methode voor het aantonen van Salmonella met behulp van de iQ Check^TMSalmonella kit (Bio-Rad Laboratories b.v.) in dons, mest en vlees afkomstig van pluimvee.

Salmonella: alle typen Salmonella waarvan het DNA aan de hand van de Polymerase Chain Reactie (PCR) wordt aangetoond, wanneer wordt getest volgens de beschreven werkwijze.

Uit een voorophopingsmedium wordt, na voorincubatie, het DNA van Salmonella geïsoleerd.

Met behulp van de real-time polymerase chain reaction (PCR) worden Salmonella-specifieke DNA sequenties gelijktijdig vermenigvuldigd en gedetecteerd middels fluorescente probes.

Inclusief voorophoping wordt een positieve of negatieve uitslag verkregen binnen 24 uur.

De samenstelling en bereiding van media en reagentia is opgenomen in bijlage 1. Er mag echter ook gebruik worden gemaakt van media die kant-en-klaar commercieel verkrijgbaar zijn. De iQ Check.^TMSalmonella kit bestaat uit kant-en-klare reagentia.

Alle gebruikte grondstoffen en het water moeten van analysekwaliteit zijn.

Voor algemene eisen en richtlijnen voor microbiologische onderzoeken wordt verder verwezen naar NEN-EN-ISO 7218:2005 Ontw.

De gebruikelijke apparatuur voor een moleculair/microbiologisch laboratorium en de voor de iQ Check^TMSalmonella test benodigde apparatuur en verbruiksmaterialen, zoals onderstaand vermeld:

Opmerking: Gesteriliseerde materialen voor éénmalig gebruik mogen worden toegepast.

Apparatuur

5.1 iCycler Thermal Cycler met 96-wells reactiemodule (Bio-Rad cat. #: 170-8720)

5.2 iCycler iQ Optical Module (Bio-Rad cat. #: 170-8740)

5.3 iCycler iQ Filter set Texas Red/ Rox Dyes (Bio-Rad cat. #: 170-8781)

5.4 Stomacher

5.5 Broedstoof voor het bebroeden bij 37 ± 1 °C

5.6 Verhittingsblok voor 1,5 ml buizen 100 ± 1 °C

5.7 Tafelcentrifuge (maximaal 12.000 rpm, voor 1,5 ml buizen)

5.8 Vortex

5.9 Magnetische roerder

5.10 20 µl, 200 µl and 1000 µl micropipetten

5.11 Combi-tips pipetten

Opmerking: Het gebruik van een universal power source (UPS) in combinatie met de iCycler iQTM wordt aanbevolen. Inmiddels staat ook de Chromo4 Real time PCR machine in de gebruiksaanwijzing vermeld.

Verbruiksmaterialen

5.12 iCycler iQ 96-well PCR platen (Bio-Rad cat. #: 223-9441)

5.13 iCycler iQ Optical sealing tape (Bio-Rad cat. #: 223-9444)

5.14 200 ml 8-strip tubes (Bio-Rad cat. #: 223-9469)

5.15 200 ml 8-strip caps for 200 µl tubes (Bio-Rad cat. #: 223-9472)

5.16 Stomacher zakken met filter

5.17 1 ml en 10 ml pipetten

5.18 Steriele filtertips, passend op 20 µl, 200 µl en 1000 µl micropipetten

5.19 1,5 ml Eppendorf SafeLock buisjes

5.20 Combi-tips tips, steriel, individueel verpakt

5.21 2 ml and 5 ml steriele buizen of flesjes

5.22 Poeder-vrije handschoenen

5.23 Milli-Q of gedestilleerd steriel water

5.24 Ethanol 96% of NaOH 5%

Opmerking:

MLP-9601 PCR plates (Bio-Rad) in combinatie met MSB 1001 Sealing film is ook mogelijk.

De test dient te worden uitgevoerd door op juiste wijze getraind personeel.

Monsters en kweken dienen te worden behandeld en afgevoerd als potentieel infectieus materiaal.

De kwaliteit van de resultaten is afhankelijk van een strikte uitvoering conform Good Laboratory Practice, in het bijzonder aangaande PCR:

1. •

   Gebruik specifieke, gescheiden sets laboratorium benodigdheden zoals pipetten en buizen voor bijvoorbeeld DNA extractie en de bereiding van PCR mix.

2. •

   Het is van groot belang dat gebruik wordt gemaakt van een positieve en negatieve controle in elke serie van amplificatie reacties (‘PCR run’).

3. •

   Gebruik geen reagentia waarvan de houdbaarheidsdatum is verstreken.

4. •

   Homogeniseer reagentia voorafgaand aan gebruik.

5. •

   Controleer regelmatig de nauwkeurigheid en precisie van alle pipetten en apparatuur.

6. •

   Verwissel handschoenen met enige regelmaat, vooral indien contaminatie wordt verondersteld.

7. •

   Voer periodieke reiniging uit van de werkplaats met tenminste 5% bleekmiddel.

8. •

   Vermijdt gebruik van latex handschoenen met poeder. Voorkom vingerafdrukken op het optisch sealing tape.

9. •

   Schrijf niet op de dopjes van PCR-buizen. In beide gevallen zal de real-time dataacquisitie hinder ondervinden.

Bederfelijke pluimveeproducten zoals borstvellen en filet dienen gekoeld (1-8°C) te worden aangeleverd. Zie voor de acceptatie criteria voor monstermateriaal bijlage III.

De monsters dienen binnen 4 uur na ontvangst ingezet te worden. Indien de monsters echter binnen 48 uur na monstername op het laboratorium aanwezig zijn, mag gewacht worden met het inzetten van de monsters totdat maximaal 48 uur + 4 uur na het tijdstip van monstername is verstreken.

Stel monsters zo min mogelijk bloot aan temperatuurschommelingen.

Opmerking:

Komen mestmonsters mee met vleesmonsters in een koelbox, sla dan alle monsters gekoeld op. Worden mestmonsters per post ongekoeld verstuurd, sla dan op bij kamertemperatuur, tenzij deze monsters pas de volgende dag worden ingezet.

Ophopingsmedium dient op incubatie temperatuur (37°C) te zijn voorafgaand aan gebruik.

Homogenizeer 25 g monster in 225 ml gebufferd pepton water, in een stomacher zak met filter.

Incubeer zonder schudden gedurende 21 uur ± 1 uur bij 37°C.

Opmerking:

Bij verwerking van borstvel ten behoeve van de verdunning dient zo min mogelijk onderhuids vet meegesneden te worden; een overmaat vet kan de isolatie van DNA bemoeilijken en inhibitie van de PCR-reactie veroorzaken. Mest en dons vergen geen bijzondere voorbehandeling.

Pipetteer 1 ml ophoping met een disposable pipet in een 1,5 ml Eppendorf buis (voorkom pipetteren van grote fragmenten van monsterresten). Schudt de ophoping niet voorafgaand aan het pipetteren van het monster.

De overige stappen voor de DNA extractie worden uitgevoerd zoals omschreven in de gebruiksaanwijzing van de iQ Check^TMSalmonella testkit (Bio-Rad, 2004).

Opmerking:

In geval van ophopingen met een vettig supernatant, neem het monster juist onder deze vetlaag.

Apparatuur en software gebruik, uitvoering PCR en data analyse worden allen uitgevoerd zoals omschreven in de gebruiksaanwijzing van de iQ Check^TMSalmonella testkit (Bio-Rad, 2004).

Resultaten worden geïnterpreteerd middels analyse van de Ct-waarden (threshold cycle) van elk monster. Volg hiervoor het voorschrift van de fabrikant.

Een positief Salmonella monster dient een Ct-waarde > / = 10 voor de FAM fluorophore te hebben.

Indien de Ct-waarde lager dan 10 is, dient het verloop van de amplificatiecurve gecontroleerd te worden via de ‘Background subtracted’ mode; de curve dient een vlakke basislijn te vertonen, gevolgd door een geleidelijke toename van fluorescentie. Indien de curve correct is, kan het monster positief voor Salmonella worden bevonden.

Indien geen Ct-waarde (Ct = N/A, ‘not applicable’) voor FAM is toegekend aan een monster, of de curve een niet-kenmerkend verloop vertoont, moet de interne controle van dat monster worden geanalyseerd. Wanneer geen Ct-waarde (Ct = N/A) wordt verkregen voor FAM, dan is de uiteindelijke interpretatie van het resultaat afhankelijk van de interne controle:

1. •

   Een monster wordt negatief beschouwd voor Salmonella indien geen Ct-waarde voor FAM is toegekend, en de interne controle (Texas Red) een Ct-waarde > 10 heeft.

2. •

   Indien de interne controle ook geen Ct-waarde is toegekend (Ct = N/A), dan is interpretatie van het resultaat onmogelijk. Een dergelijk resultaat kan een indicatie zijn van remming van de PCR reactie. In dit geval dient het monster (DNA-extract) 1/10 verdund te worden in steriel gedestilleerd water en moet de PCR reactie worden herhaald.

Interpretatie van monsterresultaten:

* Wanneer zowel Salmonella als interne controle detectie een Ct = N/A oplevert, dient het monster opnieuw getest te worden middels een 1/1 0 verdunning van het DNA-extract.

Opmerking:

Bio-Rad heeft inmiddels software ter beschikking gesteld waarin de FAM en Texas Red waarden via ‘Copy-Paste’ ingevuld kunnen worden. Er volgen automatisch antwoorden per monster als: positief, negatief en inhibitie. Tevens worden automatisch de waarden van de kitcontroles gevalideerd. Dit rapport kan in een PDF file geconverteerd worden. De software heet : iQCheck Analysis TM.

Voor een positief resultaat geldt: Salmonella aangetoond.

Voor een negatief resultaat geldt: Salmonella niet aangetoond.

Verdere bevestiging van positieve uitslagen verkregen met de iQ Check^TMSalmonella test is ter beoordeling van de gebruiker maar is niet vereist.

Omdat echter in alle gevallen van Salmonella-positieve monsters betreffende het PVE actieplan 2000+ een nadere serotypering van de Salmonella bevinding is vereist, dient met dezelfde BPw-voorophoping als waaruit de PCR is uitgevoerd alsnog een isolatie met MSRV en XLD uitgevoerd te worden volgens PVE-SALMONELLA-MSRV-140607, gevolgd door serotypering van het isolaat (PVE-SALMONELLA-SERQ-140607).

De iQ Check^TMSalmonella test kit bevat een positieve en een negatieve controle. Een additionele interne controle in elk monster bepaald de efficiëntie van de PCR-reactie en is een indicator voor vals-negatieve reacties. Genoemde controles worden in elke test meegenomen.

Ten behoeve van de validatie van het gehele experiment dienen de controles te voldoen aan de volgende eisen, weergegeven in onderstaande tabel. Is dit niet het geval, dan moet de PCR reactie worden herhaald.

* De software geeft een Ct waarde ‘N/A (not applicable)’ indien de fluorescentie van een monster niet significant boven de achtergrond ruis uitkomt en dus de threshold niet snijdt.

Voor de eerstelijnscontrole van de methode als geheel dienen te worden meegenomen:

1. –

   Blanco controle,

2. –

   Negatieve controle (indien een ingangscontrole per batch wordt toegepast, kan deze negatieve controle komen te vervallen),

3. –

   Positieve controle.

Geef het resultaat op als ‘Salmonella aangetoond / niet aangetoond in het betreffende monstermateriaal’ als Salmonella al dan niet is aangetoond volgens dit protocol. Bij de uitslag kan tussen haakjes aangegeven worden hoeveel gram monstermateriaal is onderzocht.

Indien bij het aanleveren van de monsters afwijkingen worden geconstateerd van de wijze waarop de monsters aangeleverd moeten worden (zie bijlage III), dan dient het laboratorium op het analysecertificaat hierover een opmerking te maken en de eventuele gevolgen voor de betrouwbaarheid van de uitslag aan te geven.

1. •

   AFNOR Validation Certificate, iQ Check^TMSalmonella, attest BRD-07/06-07/04.

2. •

   Gebruiksaanwijzing van de iQ Check^TMSalmonella Test. Bio-Rad Laboratories b.v., 30 augustus 2004, Veenendaal, NL.

3. •

   Miras l., Hermant N., Arricau N., Popoff M.Y. Nucleotide sequence of lagA and lagB genes involved in invasion of HeLa cells by Salmonella enterica subsp. Enterica ser. Typhy. Research in Microbiology, Vol. 146 (1): 17-20 (1995).

4. •

   NEN-EN-ISO 6579:2002. Microbiologie van voedingsmiddelen en diervoeders – Horizontale methode voor het aantonen van Salmonella spp. Nederlands Normalisatie Instituut, Delft.

5. •

   NEN-EN-ISO 7218:2005 Ontw. En. Microbiologie van voedingsmiddelen en diervoeders – Algemene eisen en richtlijn voor microbiologische onderzoeken. Nederlands Normalisatie Instituut, Delft.

6. •

   PVE-SALMONELLA-MSRV-140607. PVE Branchemethode voor het aantonen van Salmonella met behulp van MSRV in dons, mest en vlees, afkomstig van pluimvee. Productschap Vee, Vlees en Eieren, Zoetermeer. www.pve.nl

7. •

   PVE-SALMONELLA-SERO-140607. Toelichting op de serotypering van Salmonella volgens het Kauffmann-White schema. Productschap Vee, Vlees en Eieren, Zoetermeer. www.pve.nl

8. •

   Tyagi, S. and Kramer, F.R. Molecular Beacons: Probes that fluoresce upon hybridization. Nature Biotechnology 14: 303-308 (1996).

Samenstelling:

Bereiding:

1. –

   Los de ingrediënten op in het water (indien nodig d.m.v. verhitting);

2. –

   Indien nodig, stel de pH, zodat deze na sterilisatie 7,2 ± 0,2 bij 25°C bedraagt;

3. –

   Verdeel het medium over daarvoor geschikte flessen of potten;

4. –

   Steriliseer in een autoclaaf (15 min. 121°C) .

Samenstelling:

De iQ-Check^TMSalmonella kit, Bio-Rad code 357-8 100, bevat reagentia ten behoeve van 96 testen.

PVE Branchemethode voor het aantonen van thermotolerante Campylobacter met behulp van Preston en CCDA in mest en vlees, afkomstig van pluimvee.

Dit protocol beschrijft een methode voor het aantonen van thermotolerante Campylobacter (in dit protocol verder als Campylobacter aangeduid) in monsters mest en vlees, afkomstig van pluimvee.

Campylobacter: micro-organismen die de voor deze bacteriën karakteristieke groei vertonen en specifieke morfologische, biochemische en serologische reacties vertonen wanneer wordt gekweekt respectievelijk getest volgens de beschreven werkwijze.

Mestmonsters en blindedarm mestmonsters worden rechtstreeks geënt op een selectieve vaste voedingsbodem (mCCDA).

Vlees (bijvoorbeeld vel van de borstkap of filet) wordt in porties van 25 gram gedurende 1 minuut gestomacherd met 100 ml selectief ophopingsmedium (Preston). Hierna wordt het monstermateriaal verwijderd en alleen het ophopingsmedium gedurende 24 uur bebroed bij 41,5 °C. Vervolgens wordt afgeënt op een selectieve vaste voedingsbodem (mCCDA).

Selectieve vaste voedingsbodems worden microaëroob gedurende 48 uur bij 41,5 °C bebroed, waarna beoordeeld wordt op aanwezigheid van specifieke kolonies.

Specifieke kolonies worden bevestigd met behulp van oxidase reactie en microscopie. Als extra controle kan een deel van de isolaten met behulp van een latex agglutinatie test worden bevestigd.

Alle gebruikte grondstoffen en het water moeten van analysekwaliteit zijn.

Er mag ook gebruik worden gemaakt van media die kant-en-klaar commercieel verkrijgbaar zijn.

Voor algemene eisen en richtlijnen voor microbiologische onderzoeken wordt verder verwezen naar NEN-EN-ISO 7218:2005 Ontw.

4.2.1 Preston basismedium

4.2.1.1 Samenstelling

OPMERKING

^a ook tezamen kant-en-klaar verkrijgbaar onder de naam Nutriënt Broth No.2

^b ook tezamen verkrijgbaar als supplement (zgn. ‘groeisupplement’ of FBP supplement)

4.2.1.2 Bereiding

Los de ingrediënten op in het water (indien nodig d.m.v. verhitting).

Indien nodig, stel de pH, zodat deze na sterilisatie 7,5 ± 0,2 bij 25° C bedraagt.

Steriliseer gedurende 15 minuten bij 121 °C ± 1 °C.

4.2.2 Preston antibiotica oplossing

4.2.2.1 Samenstelling

OPMERKING

Deze antibiotica zijn ook tezamen verkrijgbaar als Preston supplement. Let op, ook het ‘vroeger’ gebruikte Preston supplement, met cycloheximide in plaats van amphotericine-B, is nog steeds verkrijgbaar. De voorkeur wordt echter gegeven aan gebruik van supplement met amphotericine-B.

4.2.2.2 Bereiding

Los de antibiotica op in het water en steriliseer door middel van filtratie (0,22 µm filter)

4.2.3 Compleet Preston ophopingsmedium

4.2.3.1 Samenstelling compleet Preston ophopingsmedium

4.2.3.2 Bereiding compleet Preston ophopingsmedium

Koel het basismedium af tot onder de 47°C.

Voeg op aseptische wijze de antibiotica oplossing toe en meng zorgvuldig.

OPMERKING

In de originele beschrijving van Preston ophopingsmedium wordt paardenbloed gebruikt. In dit voorschrift wordt echter geen paardenbloed toegepast, omdat uit onderzoek is gebleken dat dat voor onderhavige monstermatrix niet noodzakelijk is (Jacobs-Reitsma et al., 2003).

4.3.1 mCCDA Basismedium

4.3.1.1 Samenstelling

OPMERKING

a ook tezamen kant-en-klaar verkrijgbaar onder de naam Nutriënt Broth No.2

4.3.1.2 Bereiding

Los de ingrediënten op in het water (indien nodig d.m.v. verhitting).

Indien nodig, stel de pH, zodat deze na sterilisatie 7,4 °C ± 0,2 bij 25 °C bedraagt.

Steriliseer gedurende 15 minuten bij 121 °C ± 1 °C.

4.3.2 mCCDA antibiotica supplement

4.3.2.1 Samenstelling

OPMERKING

Deze antibiotica zijn ook tezamen verkrijgbaar als mCCDA supplement.

4.3.2.2 Bereiding

Los de antibiotica op in het water en steriliseer door middel van filtratie (0,22 µm filter)

4.3.3 Complete mCCDA voedingsbodem

4.3.3.1 Samenstelling

4.3.3.2 Bereiding

Koel het basismedium af tot 47-50 °C.

Voeg op aseptische wijze de antibiotica oplossing toe en meng zorgvuldig.

Giet de agar uit in petrischalen met nok en laat stollen.

4.4.1 Oxidase reagens

4.4.1.1 Samenstelling

4.4.1.2 Bereiding

Los het N,N,N’,N’-tetramethyl-1,4-fenyleendiammoniumdichloride op in het water. Bereid het reagens vlak voor uitvoering van de oxidasetest.

Dit reagens is ook kant-en-klaar commercieel verkrijgbaar. Handel dan volgens de gebruiksaanwijzing van de fabrikant.

4.4.2 Latexagglutinatietest voor bevestiging van Campylobacter

Latexagglutinatietesten voor bevestiging van thermotolerante Campylobacter zijn commerciëel verkrijgbaar.

Gebruikelijke toestellen en steriel glaswerk voor microbiologische laboratoria en in het bijzonder de onderstaande:

5.1 Broedstoof voor het bebroeden bij 41,5 °C ± 1 °C.

5.2 Suspendeertoestel, Stomacher 5.3 Geschikte apparatuur en hulpmiddelen om te bebroeden in een micro-aërobe atmosfeer (ca. 6% zuurstof, 10% kooldioxide en 84% stikstof). Voor het verkrijgen van microaëroob milieu kan gebruik gemaakt worden van commerciële systemen (‘gas-zakjes’).

5.4 Microscoop, bij voorkeur met fase-contrast, vergroting 1000x.

OPMERKING

Gesteriliseerde materialen voor éénmalig gebruik mogen worden toegepast.

Bederfelijke pluimveeproducten zoals borstvellen en filet dienen gekoeld (l -8 °C) te worden aangeleverd. Zie voor de acceptatie criteria voor monstermateriaal bijlage III.

De monsters dienen binnen 4 uur na ontvangst ingezet te worden. Indien de monsters echter binnen 48 uur na monstername op het laboratorium aanwezig zijn, mag gewacht worden met het inzetten van de monsters totdat maximaal 48 uur + 4 uur na het tijdstip van monstername is verstreken.

Stel monsters zo min mogelijk bloot aan temperatuurschommelingen.

Opmerking:

Komen mestmonsters mee met vleesmonsters in een koelbox, sla dan alle monsters gekoeld op. Worden mestmonsters per post ongekoeld verstuurd, sla dan op bij kamertemperatuur, tenzij deze monsters pas de volgende dag worden ingezet.

Campylobacter is zeer gevoelig voor invriezen en daarom is het invriezen van monsters niet toegestaan.

In alle gevallen geldt dat de agarplaten na beënten zonder uitstel onder micro-aërobe condities geïncubeerd dienen te worden, omdat Campylobacter obligaat micro-aërofiel is en onder andere omgevingscondities snel afsterft.

6.2.1 Monstervoorbehandeling

Monsters waarin hoge aantallen Campylobacter worden verwacht, zoals mest en blindedarm, worden rechtstreeks op het isolatiemedium afgestreken.

Maak 1 mengmonster van de 30 afzonderlijke blindedarmen door deze elk op steriele wijze open te knippen en uit elke darm een evenredige hoeveelheid materiaal over te brengen in een lege steriele petrischaal. Meng goed (bijvoorbeeld met een steriele swab of entoog).

6.2.2 Isolatie

Beënt vanuit het mengmonster met behulp van de swab of entoog een halve mCCDA-plaat.

Beënt de rest van de plaat middels verdunningsstrepen met behulp van een steriele öse, zodanig dat na incubatie losliggende kolonies kunnen ontstaan.

Incubeer mCCDA platen micro-aëroob gedurende 48 uur ± 4 uur bij 41, 5 °C ± 1°C.

6.3.1 Monstervoorbehandeling

Breng 25 gram ± 1 gram van het monster, bijvoorbeeld een stuk huid van de borstkap of filet, in een stomacherzak en voeg 100 ml Preston bouillon toe. Stomacher gedurende 1 minuut en scheidt het monstermateriaal van de ophopingsbouillon (bijvoorbeeld door het verwijderen van de binnenzak van de stomacherzak met daarin het monstermateriaal of door overschenken van de ophopingsvloeistof in een schoon steriel flesje).

6.3.2 Ophoping

Incubeer de ophopingsbouillon 24 uur ± 2 uur bij 41, 5 °C ± 1 °C in micro-aëroob milieu.

Indien geïncubeerd wordt in flesjes of (stomacher)-zakken met weinig kopruimte (d.w.z. < / = 2 cm), kan zonder eisen aan het milieu geïncubeerd worden.

6.3.3 Isolatie

Ent met behulp van een entoog (10 µl) de Preston-cultuur na incubatie uit op een mCCDA-plaat. Incubeer mCCDA platen micro-aëroob gedurende 48 uur ± 4 uur bij 41,5 °C ± 1°C.

Beoordeel bebroede mCCDA-platen op de aanwezigheid van kolonies met de volgende morfologische eigenschappen: grijs, metalig, laag convex, amorf en de neiging om met de entstreep mee te groeien. Deze kolonies worden als ‘verdacht positief’ aangemerkt.

Voer de bevestiging uit met minimaal 1 tot maximaal 3 verdachte kolonies per plaat in geval van reincultuur en tot 5 verdachte kolonies (indien aanwezig) in geval van mengcultuur, totdat een positief resultaat wordt verkregen.

Ter bevestiging wordt een oxidase reactie uitgevoerd en worden de verdachte kolonies microscopisch beoordeeld. Voer zonodig eerst een reinstrijk uit op bijvoorbeeld een bloedplaat of een mCCDA-basis agar plaat (zonder antibiotica supplement).

Ent met een entoog (anders dan van nikkel/chroom) vanaf de mCCDA plaat een verdachte kolonie op een filtreerpapiertje bevochtigd met oxidasereagens. Lees na maximaal 10 seconden de reactie af. De reactie is positief bij paarskleuring en negatief indien er geen verkleuring optreedt.

Maak van de verdachte kolonie een hangende-druppel-preparaat of nat-preparaat en beoordeel met een fasecontrast of donkerveld microscoop (100x objectief) op de karakteristieke kurketrekker-vormige morfologie en grote beweeglijkheid van Campylobacter.

Bij kleuring volgens Gram tonen Campylobacter bacteriën zich als kurketrekker-vormig gebogen Gram-negatieve staafjes. De karakteristieke vorm is ook goed te zien bij kleuring met Oost-Indische inkt. Bij oude culturen ( > 2 dagen op plaat) kan Campylobacter coccoïde en minder beweeglijke vormen aannemen.

Bij twijfel of als extra controle op de juiste identificatie wordt aanbevolen om regelmatig een aanvullende bevestiging uit te voeren met een latexagglutinatietest, bijvoorbeeld met 1 op 50 bevestigde kolonies.

7.4.1 Latexegglutinatietest

Latexagglutinatietesten zijn bij diverse firma’s commercieel verkrijgbaar en moeten volgens de gebruiksaanwijzing van de fabrikant worden uitgevoerd en afgelezen.

Campylobacter bacteriën vertonen de karakteristieken zoals omschreven in tabel 1.

Voor de eerstelijnscontrole van de methode dienen te worden meegenomen:

1. –

   Blanco controle,

2. –

   Negatieve controle (indien een ingangscontrole per batch wordt toegepast, kan deze negatieve controle komen te vervallen),

3. –

   Positieve controle.

Geef het resultaat op als ‘Campylobacter aangetoond / niet aangetoond in het betreffende monstermateriaal’ als Campylobacter al dan niet is aangetoond volgens dit protocol. Bij de uitslag kan tussen haakjes aangegeven worden hoeveel gram monstermateriaal is onderzocht.

Indien bij het aanleveren van de monsters afwijkingen worden geconstateerd van de wijze waarop de monsters aangeleverd moeten worden (zie bijlage III), dan dient het laboratorium op het analysecertificaat hierover een opmerking te maken en de eventuele gevolgen voor de betrouwbaarheid van de uitslag aan te geven.

1. •

   Jacobs-Reitsma, W. (1994). Epidemiology of Campylobacter in Poultry. Thesis Agricultural University Wageningen, The Netherlands.

2. •

   Jacobs-Reitsma W., M. van der Wal, R. Achterberg and J. Wagenaar. Comparative studies on Campylobacter isolation methods from fresh poultry products. Posterpresentation A-12 at the 12th International Workshop on Campylobacter, Helicobacter and Related Organisms, September 2003, Aarhus, Denmark. Intern. J. of Med. Microbiol., Vol. 293 Suppl. 35, p. 6-7.

3. •

   NEN-EN-ISO 10272:1995. Microbiology of food and animal feeding stuffs – Horizontal method for the detection of thermotolerant Campylobacter + technical corrigenda (ISOIO272:1995/Cor.1:1996(E) and ISO 10272:1995/Cor:1997(E). Nederlands Normalisatie Instituut, Delft.

4. •

   NEN-EN-ISO 7218:2005 Ontw. En. Microbiologie van voedingsmiddelen en diervoeders - Algemene eisen en richtlijn voor microbiologische onderzoeken. Nederlands Normalisatie Instituut, Delft.

PVE Branchemethode voor het aantonen van thermotolerante Campylobacter spp. met behulp van VIDAS CAM in vlees, afkomstig van pluimvee.

Dit protocol beschrijft een methode voor het aantonen van thermotolerante Campylobacter (in dit protocol verder als Campylobacter aangeduid) in vlees, afkomstig van pluimvee.

Campylobacter: alle typen Campylobacter waarvan de specifieke antigenen met behulp van de Enzyme Linked Fluorescent Assay (ELFA) techniek worden aangetoond, wanneer wordt getest volgens de beschreven werkwijze.

VIDAS CAM is een enzym immunoassay voor de detectie van Campylobacter antigenen, waarbij gebruik wordt gemaakt van de ELFA methode en die geautomatiseerd wordt uitgevoerd op het VIDAS analyse apparaat.

Pluimveevlees (bijvoorbeeld vel van de borstkap of filet) wordt in porties van 25 gram gedurende 1 minuut gestomacherd met 100 ml selectief ophopingsmedium (Preston). Hierna wordt het monstermateriaal verwijderd en alleen het ophopingsmedium gedurende 48 uur bebroed bij 41,5 °C. Vervolgens wordt de VIDAS CAM assay uitgevoerd. Het test resultaat van deze aantoningsstap is na ca. 70 minuten beschikbaar. Verdere bevestiging van positieve uitslagen is niet noodzakelijk.

Alle gebruikte grondstoffen en het water moeten van analysekwaliteit zijn.

Er mag ook gebruik worden gemaakt van media die kant-en-klaar commercieel verkrijgbaar zijn.

Voor algemene eisen en richtlijnen voor microbiologische onderzoeken wordt verder verwezen naar NEN-EN-ISO 7218:2005 Ontw.

4.2.1 Preston basismedium

4.2.1.1 Samenstelling

OPMERKING

^a ook tezamen kant-en-klaar verkrijgbaar onder de naam Nutriënt Broth No.2

^book tezamen verkrijgbaar als supplement (zgn. ‘groeisupplement’ of FBP supplement)

4.2.1.2 Bereiding

Los de ingrediënten op in het water (indien nodig d.m.v. verhitting).

Stel de pH zo in dat deze na sterilisatie 7,5 ± 0, 2 bedraagt bij 25°C.

Steriliseer gedurende 15 minuten bij 121 °C ± 1°C.

4.2.2 Preston antibiotica oplossing

4.2.2.1 Samenstelling

OPMERKING

Deze antibiotica zijn ook tezamen verkrijgbaar als Preston supplement. Let op, ook het ‘vroeger’ gebruikte Preston supplement, met cycloheximide in plaats van amphotericine-B, is nog steeds verkrijgbaar. De voorkeur wordt echter gegeven aan gebruik van supplement met amphotericine-B.

4.2.2.2 Bereiding

Los de antibiotica op in het water en steriliseer door middel van filtratie (0,22 µm filter).

4.2.3 Compleet Preston ophopingsmedium

4.2.3.1 Samenstelling compleet Preston ophopingsmedium

4.2.3.2 Bereiding compleet Preston ophopingsmedium

Koel het basismedium af tot onder de 47°C.

Voeg op aseptische wijze de antibiotica oplossing toe en meng zorgvuldig.

OPMERKING

In de originele beschrijving van Preston ophopingsmedium wordt paardenbloed gebruikt. In dit voorschrift wordt echter geen paardenbloed toegepast, omdat uit onderzoek is gebleken dat dat voor onderhavige monstermatrix niet noodzakelijk is (Jacobs-Reitsma et al., 2003).

Gebruikelijke toestellen en steriel glaswerk voor microbiologische laboratoria en in het bijzonder de onderstaande:

5.1 Broedstoof voor het bebroeden bij 41,5 °C ± 1°C.

5.2 Suspendeertoestel, Stomacher

5.3 Geschikte apparatuur en hulpmiddelen om te bebroeden in een micro-aërobe atmosfeer (ca. 6% zuurstof, 10% kooldioxide en 84% stikstof). Voor het verkrijgen van microaëroob milieu kan gebruik gemaakt worden van commerciële systemen (‘gas-zakjes’), bijvoorbeeld:

GenBox micro-aërofiel (10 zakjes, ref. 96125, bioMérieux).

5.4 VIDAS of mini VIDAS analyser (bioMérieux).

5.5 VIDAS CAM assay (30 testen, ref. 30111, bioMérieux)

OPMERKING

Gesteriliseerde materialen voor éénmalig gebruik mogen worden toegepast.

Bederfelijke pluimveeproducten zoals borstvellen en filet dienen gekoeld (1-8 °C) te worden aangeleverd. Zie voor de acceptatie criteria voor monstermateriaal bijlage III.

De monsters dienen binnen 4 uur na ontvangst ingezet te worden. Indien de monsters echter binnen 48 uur na monstername op het laboratorium aanwezig zijn, mag gewacht worden met het inzetten van de monsters totdat maximaal 48 uur + 4 uur na het tijdstip van monstername is verstreken.

Campylobacter is zeer gevoelig voor invriezen en daarom is het invriezen van monsters niet toegestaan.

Breng 25 gram ± 1 gram van het monster, bijvoorbeeld een stuk huid van de borstkap of filet, in een stomacherzak en voeg 100 ml Preston bouillon toe. Stomacher gedurende 1 minuut en scheidt het monstermateriaal van de ophopingsbouillon (bijvoorbeeld door het verwijderen van de binnenzak van de stomacherzak met daarin het monstermateriaal of door overschenken van de ophopingsvloeistof in een schoon steriel flesje).

Incubeer de ophopingsbouillon 48 uur ± 2 uur bij 41, 5 °C ± 1 °C in micro-aëroob milieu.

Indien geïncubeerd wordt in flesjes of (stomacher)-zakken met weinig kopruimte (d.w.z. < / = 2 cm), kan zonder eisen aan het milieu geïncubeerd worden.

OPMERKING

In tegenstelling tot PVE-CAMPYLOBACTER-140607 is de incubatietijd in dit voorschrift 48 uur.

Meng het ophopingsmedium na incubatie en breng 2 ml over in een eppendorfbuisje. Sluit de buisjes en verhit gedurende 15 minuten in een kokend waterbad. Voer vervolgens de VIDAS CAM test uit volgens de gebruiksaanwijzing. Runtime VIDAS CAM test bedraagt ongeveer 70 minuten.

OPMERKING

Indien de VIDAS CAM test niet direct kan worden uitgevoerd is het mogelijk de ophoping (of een deel ervan) in te vriezen voor maximaal 48 uur. Na ontdooien moet de ophoping opgekookt worden en kan bovenstaande werkwijze worden gevolgd.

Resultaten worden beoordeeld conform de gebruiksaanwijzing van de VIDAS CAM test.

Deze zijn gebaseerd op metingen van de fluorescentie en worden gestandaardiseerd naar een zogenaamde Test Value (TV). Resultaten met een TV onder de 0,1 betreffen monsters waarin Campylobacter antigenen niet aantoonbaar waren. Resultaten met een TV = 0,1 worden als Campylobacter-positief gerapporteerd.

De in dit voorschrift beschreven VIDAS CAM methode is een detectie methode. Verdere confirmaties zijn niet nodig.

De VIDAS CAM test kit bevat een positieve en een negatieve VIDAS reagens controle en een bijbehorende standaard. Deze worden meegenomen in de bepalingen zoals omschreven in de gebruiksaanwijzing van de VIDAS CAM test.

Voor de eerstelijnscontrole van de methode als geheel dienen te worden meegenomen:

1. –

   Blanco controle,

2. –

   Negatieve controle (indien een ingangscontrole per batch wordt toegepast, kan deze negatieve controle komen te vervallen),

3. –

   Positieve controle.

Geef het resultaat op als ‘Campylobacter aangetoond / niet aangetoond in het betreffende monstermateriaal’ als Campylobacter al dan niet is aangetoond volgens dit protocol. Bij de uitslag kan tussen haakjes aangegeven worden hoeveel gram monstermateriaal is onderzocht.

Indien bij het aanleveren van de monsters afwijkingen worden geconstateerd van de wijze waarop de monsters aangeleverd moeten worden (zie bijlage III), dan dient het laboratorium op het analysecertificaat hierover een opmerking te maken en de eventuele gevolgen voor de betrouwbaarheid van de uitslag aan te geven.

1. •

   Jacobs-Reitsma, W., M. van der Wal, E. Samuëls and J. Wagenaar. Evaluation of the VIDAS Campylobacter Assay for detection of Campylobacter in fresh poultry products after various enrichment methods. Posterpresentation A-18 at 12th International Workshop on Campylobacter,Helicobacter and Related Organisms, September 2003, Aarhus, Denmark. Intern. J. Med. Microbiol., Vol. 293 Suppl. 35, p. 6.

2. •

   Jacobs-Reitsma, W., M. van der Wal, R. Achterberg, J. Wagenaar. Comparative studies on Campylobacter isolation methods from fresh poultry products. Posterpresentation A-21 at 12th International Workshop on Campylobacter, Helicobacter and Related Organisms, September 2003, Aarhus, Denmark. Intern. J. Med. Microbiol., Vol. 293 Suppl. 35, p. 6-7.

3. •

   NEN-EN-ISO 7218:2005 Ontw. En. Microbiologie van voedingsmiddelen en diervoeders - Algemene eisen en richtlijn voor microbiologische onderzoeken. Nederlands Normalisatie Instituut, Delft.

4. •

   PVE-CAMPYLOBACTER-140607. PVE Branchemethode voor het aantonen van thermotolerante Campylobacter met behulp van Preston en CCDA in mest en vlees, afkomstig van pluimvee. Productschap Vee, Vlees en Eieren, Zoetermeer. www.pve.nl

5. •

   Samuëls, E.L.A.M. en W. Jacobs-Reitsma, Validatierapport van de Campylobacter bepaling in de matrix pluimveevlees met behulp van de VIDAS CAM methode. (Onderzoek in het kader van het PVE Plan van Aanpak/Actieplan 2000 + Salmonella en Campylobacter in de pluimveesector), april 2004.

Indien afwijkingen in de voorgeschreven kwaliteit en wijze van aanleveren van monsters zijn geconstateerd, moet in ieder geval bij de volgende punten richting de opdrachtgever een opmerking worden gemaakt, waaruit blijkt dat er in de procedure van monstername en inzenden een afwijking is geconstateerd en om welke afwijking het gaat.

Ten algemene:

1. →

   Indien bij de inzending één van de volgende gegevens ontbreekt: monsterdatum en tijdstip, stalnummer en KIP-nummer.

2. →

   Indien monsters niet deugdelijk zijn verpakt in monsterpotten of -zakken.

3. →

   Indien monsters zodanig zijn geadresseerd dat voor transporteur en laboratorium verwarring kan ontstaan.

4. →

   Indien er tussen het tijdstip van monstername en het tijdstip van ontvangst op het laboratorium meer dan 48 uur is verstreken.

Monsters.

Inlegvellen (opfokbedrijven, opfokvermeerderingsbedrijven en vleeskuikenbedrijven):

1. a)

   Indien onvoldoende inlegvellen worden aangeleverd.

2. b)

   Indien de monsters inlegvellen onvoldoende groot zijn.

3. c)

   Indien de monsters inlegvellen niet duidelijk met mest zijn besmeurd.

Dons (broederijen):

1. a)

   Indien het monster niet minimaal 25 gram dons bevat.

2. b)

   Indien het monster geen natte dons bevat.

Mest (swabs of overschoentjes) ((op)fokbedrijven, vermeerderingsbedrijven en vleeskuikenbedrijven):

Swabs:

1. a)

   Indien onvoldoende swabs worden aangeleverd.

2. b)

   Indien de swabs onvoldoende met mest zijn besmeurd.

3. c)

   Indien de swabs niet tot twee mengmonsters zijn gepoold (tenzij de swabs individueel zijn verpakt).

Overschoentjes:

1. a)

   Indien onvoldoende paar overschoentjes zijn aangeleverd (2 paar bij vleeskuikenbedrijven en 5 paar bij fok- vermeerderingsbedrijven).

2. b)

   Indien de overschoentjes niet duidelijk met mest zijn besmeurd.

Blindedarmmest (slachterijen):

1. a)

   Indien niet minimaal 30 blindedarm monsters zijn genomen.

2. b)

   Indien de blindedarm monsters van onvoldoende formaat zijn.

Borstkapvellen (slachterijen):

1. a)

   Indien het monster vel van de borstkap niet minimaal 25 gram weegt.

2. b)

   Indien het monster niet gekoeld (1-8 °C) getransporteerd en bewaard is.

Eindproducten (slachterijen/uitsnijderijen):

1. a)

   Indien het monster eindproduct niet minimaal 25 gram weegt.

2. b)

   Indien het monster niet gekoeld (1-8 °C) getransporteerd en bewaard is.

A. Norm Salmonella detectie-ringonderzoek

Monsters met Faeces

- blanco’s: min. 80% negatief

- hoog besmette capsules: min. 80 % positief

- laag besmette capsules: min. 50 % positief

Controles

- blanco’s: 100% negatief

- hoog besmette capsules: 100 % positief

- laag besmette capsules: min. 50 % positief

Goed: Als aan bovenstaande eisen voldaan wordt

Onvoldoende: Als niet aan bovenstaande eisen voldaan wordt

• Consequenties indeling resultaten

o Goed: Geen consequenties

o Onvoldoende: Extra monsters worden nagestuurd. Wanneer bij dit extra onderzoek onvoldoende gepresteerd wordt, wordt het laboratorium tijdelijk geschorst voor de detectie van Salmonella totdat de resultaten bij een volgend ringonderzoek detectie Salmonella van het NRL ’goed’ zijn.

B. Norm Salmonella serotypering-ringonderzoek

• Voor de beoordeling van de fouten wordt uitgegaan van de opgegeven lijst van te typeren stammen per laboratorium.

• Onderverdeling in grove fouten en kleine fouten. Per grove fout krijgt het laboratorium 2 punten en per kleine fout l punt. Het totale aantal punten bepaalt hoe het laboratorium gescoord heeft bij het ringonderzoek.

o Geen fout

- Typering derden voor stammen die niet op de opgegeven lijst staan

- Niet volledig uittyperen van stammen die niet op de opgegeven lijst staan

o Kleine fouten (l punt)

- Typering derden voor stammen die op de opgegeven lijst staan

- Serotype naam fout, maar groep goed van stammen die niet op de opgegeven lijst staan

o Grove fouten (2 punten)

- Serotype naam fout en groep fout (ongeacht of het serotype op de lijst staat of niet)

- Serotype naam fout van stammen die op de opgegeven lijst staan

- Niet volledig uittyperen van stammen die op de opgegeven lijst staan

- Onterecht S. Enteritidis of S. Typhimurium afgeven

- Indeling op basis van fouten

o Goed: O - l punt

o Matig: 2 - 4 punten

o Onvoldoende: meer dan 4 punten

- Consequenties indeling resultaten

o Goed: Geen consequenties

o Matig: Advies kan worden opgevraagd bij het WKL-Salmonella te Bilthoven.

o Onvoldoende: Extra set stammen wordt nagestuurd. Wanneer bij dit extra onderzoek onvoldoende gepresteerd wordt, wordt het laboratorium tijdelijk geschorst voor het typeren totdat de resultaten bij een volgend ringonderzoek serotypering Salmonella van het NRL ’matig’ of ’goed’ zijn.

o 2 keer ’onvoldoende’: Extra set stammen wordt nagestuurd. Wanneer bij dit extra onderzoek onvoldoende gepresteerd wordt, wordt het laboratorium tijdelijk geschorst voor het typeren totdat de resultaten bij een volgend ringonderzoek serotypering Salmonella van het NRL ‘goed’ zijn.

o l keer ‘onvoldoende’ en l keer ‘matig’: Extra set stammen wordt nagestuurd. Wanneer bij dit extra onderzoek onvoldoende gepresteerd wordt, wordt het laboratorium tijdelijk geschorst voor het typeren totdat de resultaten bij een volgend ringonderzoek serotypering Salmonella van het NRL ‘matig’ of ‘goed’ zijn.

o 2 keer ’matig’: Extra set stammen wordt nagestuurd. Wanneer bij dit extra onderzoek onvoldoende gepresteerd wordt, wordt het laboratorium tijdelijk geschorst voor het typeren totdat de resultaten bij een volgend ringonderzoek serotypering Salmonella van het NRL ‘matig’ of ‘goed’ zijn.

o 3 keer ‘matig’: Extra set stammen wordt nagestuurd. Wanneer bij dit extra onderzoek onvoldoende gepresteerd wordt, wordt het laboratorium tijdelijk geschorst voor het typeren totdat de resultaten bij een volgend ringonderzoek serotypering Salmonella van het NRL ‘goed’ zijn.

NB. De score van het extra onderzoek wordt meegerekend om de uiteindelijke indeling van het laboratorium te bepalen.