Dit protocol beschrijft een methode voor het aantonen van Salmonella in dons, faeces (mest) en vellen en eindproduct afkomstig van pluimvee. De Raad voor Accreditatie heeft de methode goedgekeurd voor de matrix mest, dons, vellen en eindproduct.

Salmonella: micro-organismen die de voor deze bacteriën karakteristieke groei vertonen en specifieke biochemische en serologische reacties vertonen wanneer wordt gekweekt respectievelijk getest volgens de beschreven werkwijze.

Detectie van Salmonella: bepalen van de aan- of afwezigheid van deze micro-organismen als het onderzoek wordt uitgevoerd volgens de beschreven werkwijze.

Na voorincubatie van de te onderzoeken matrix in een voorophopingsmedium, wordt geënt op een half-vast medium, waarna wordt afgestreken op een selectief isolatiemedium.

Alle gebruikte grondstoffen en het gedestilleerde water moeten van analysekwaliteit zijn.

De samenstelling en bereiding van media en reagentia is opgenomen in bijlage 1. Er mag echter ook gebruik gemaakt worden van media die commercieel verkrijgbaar zijn.

Gebruikelijke apparatuur en glaswerk voor een microbiologisch laboratorium en in het bijzonder de onderstaande:

Gesteriliseerde materialen voor éénmalig gebruik mogen worden toegepast.

1. 5.1.

   Broedstoof voor het bebroeden bij 37 ° C ± 1 ° C

2. 5.2.

   Broedstoof voor het bebroeden bij 42 ° C ± 0,5 ° C

3. 5.3.

   Waterbad ingesteld op 47 ° C ± 2 ° C

4. 5.4.

   Steriele entnaalden met een oog met een diameter van ca. 3 mm.

5. 5.5.

   Steriele pipetten met een schaalverdeling van 0,1 ml en een meetvolume van 1 ml.

6. 5.6.

   Petrischalen met een middellijn van ca. 9 cm.

7. 5.7.

   Cultuurbuizen van 17/18 x 150 mm en van 8 x 160 mm.

De monsters dienen binnen 4 uur na ontvangst ingezet te worden. Indien de monsters echter binnen 48 uur op het laboratorium aanwezig zijn, mag gewacht worden met het inzetten van de monsters totdat maximaal 48 uur + 4 uur na de datum van monstername is verstreken.

Verdun het monster 1:10 in BPw.

In de volgende tabel¹ is ter illustratie de relatie tussen de verschillende monsterhoeveelheden en het volume BPw weergegeven:

Incubeer de potten BPw 18 ± 2 uur bij 37 ° C ± 1 ° C.

De potten mogen tussentijds gedurende 2 dagen in de koelkast bewaard worden, deze ‘koudestap’ is mogelijk.

Breng 0,1 mI BPw-cultuur op een MSRV plaat (bij 9 cm platen 3 druppels, met een gezamenlijk volume van 0,1 ml in een driehoek. Incubeer de platen 1 x 24 ± 2 uur bij 42 ° C ± 0,5 ° C. De platen moeten met het deksel van de petrischaal naar boven geïncubeerd worden, aangezien het een half-vast medium is. Niet verdachte of negatieve platen dienen nogmaals 1 x 24 ± 2 uur bij 42 ° C ± 0,5 ° C bebroed te worden. Een verdachte MSRV-plaat vertoont groei in de agar (zwerming vanuit de entingsplaats) en heeft een wit/grijze kleur. Verdachte platen worden afgeënt door aan de rand van de zwermzone met een öse materiaal uit de agar te nemen en daarmee een gedroogde BGA plaat te beënten. Incubeer deze platen gedurende 24 ± 2 uur bij 37 ° C ± 1 ° C.

Controleer de bebroede BGA-platen op de vorming van roze kolonies. Dergelijke kolonies worden als ‘vermoedelijk positief’ aangemerkt.

Voor de bevestiging uit met minimaal 1 tot maximaal 3 specifieke kolonies per plaat in geval van reincultuur en tot 5 specifieke kolonies (indien aanwezig) in geval van mengcultuur totdat een positief resultaat wordt verkregen. De kolonies worden vanaf de BGA plaat geënt in UA middels het afstrijken op het oppervlak van de agar en in TSI middels ladderen over het schuingestolde oppervlak en een steekenting tot op de bodem van de buis. Beënt tevens een buis LDC door een hoeveelheid koloniemateriaal tegen de wand van de buis net onder het vloeistof oppervlak af te strijken. De buizen worden 24 ± 2 uur bij 37 ° C ± 1 ° C geïncubeerd.

Wanneer geen goed losliggende kolonies op de BGA plaat zijn verkregen of bij de aanwezigheid van veel spreidende of overgroeiende stoorflora is het nodig ter zuivering een nieuwe reinstrijk op een gedroogde BGA- of nutriëntenagarplaat te maken. Bij verontreiniging van de Salmonella- kolonie met andere bacteriën wordt een afwijkend biochemisch patroon verkregen. Het is toegestaan om eerst de bevestigingstest met de TSI uit te voeren, en bij een verdachte uitslag door te gaan met ureum en LDC.

Na incubatie geven voor Salmonella verdachte kolonies de volgende biochemische resultaten:

Het gebruik van biochemische kits (zoals API, Crystal) is ook toegestaan.

Biochemisch verdachte kolonies dienen serologisch bevestigd te worden met een polyvalent serum. Dit werkvoorschrift is opgenomen in bijlage 3.1.

De totale beoordeling van biochemische en serologische resultaten is als volgt:

Indien een stam alleen biochemisch verdacht is, wordt deze opgestuurd naar het RIVM. Een andere mogelijkheid is het inzetten van een zogenaamde ‘lange bonte rij’ of een biochemische kit. Op het resultaat van het RIVM hoeft niet gewacht te worden, alvorens een uitslag wordt afgegeven.

Voor de donsmonsters en faecesmonsters vindt serotypering plaats voor de 4 hoofdgroepen van Salmonella (B, C, D en E) en indien van toepassing identificatie van Salmonella Enteritidis en Salmonella Typhimurium. (indien nog niet bij pluimveehouder het serotype nog niet bekend is). In bijlage IV is het werkvoorschrift opgenomen.

Voor de eerstelijnscontrole ² van de methode dienen te worden meegenomen:

1. Positieve controle

2. Negatieve controle

3. Blanco controle

De eerstelijnscontroles met MSRV platen staan beschreven in bijlage 2.

Geef het resultaat op als ‘aan- of afwezigheid van Salmonella in het betreffende monstermateriaal’ (zie bijlage III) als Salmonella al dan niet is aangetoond volgens dit protocol. Bij de uitslag kan tussen haakjes aangegeven worden om hoeveel gram het ongeveer gaat dat is onderzocht.

Indien bij het aanleveren van de monsters door de opdrachtgever afwijkingen worden geconstateerd van de wijze waarop de monsters aangeleverd moeten worden, dan dient het laboratorium hierover schriftelijk een opmerking te maken richting de opdrachtgever (zie bijlage V).

1. NEN-EN 12824 Microbiologie van voedingsmiddelen en diervoeders - horizontale methode voor het aantonen van Salmonella (ISO 6579:1993, gewijzigd).

2. Zee, van der H., E. De Boer, P. Van Netten, 1990, Salmonella isolatie met behulp van MSRV, De Ware (n) chemicus 20: 189-199.

3. Hartman, dr. E.G., Validatierapport van de isolatie van Salmonella uit de matrix pluimvee faeces m.b.v. het Modified Semi-solid Rappaport Vassiliadis (MSRV)-medium, september 1999

samenstelling:

bereiding:

1. Los de ingrediënten op in het water (indien nodig d.m.v. verhitting).

2. Stel de pH, zodat deze na sterilisatie 7,2 ± 0,2 bedraagt bij 25 ° C.

3. Verdeel het medium over daarvoor geschikte flessen.

4. Steriliseer in een autoclaaf (15 min. 121 ° C).

oplossing A (basis):

bereiding

1. Los de ingrediënten op in het water.

2. Breng het mengsel onder voortdurend schudden aan de kook (NIET AUTOCLAVEREN).

3. Stel de pH op 5,2 ± 0,2.

4. Koel het mengsel af tot 50 ° C.

oplossing B (novobiocine):

1. Los 10 mg novobiocine op in 2 ml gedestilleerd/demi water.

2. Steriliseer de oplossing d.m.v. filtratie (filter 22 μ m).

bereiding MSRV medium:

1. Voeg oplossing B toe aan 500 ml oplossing A.

2. Meng de oplossing.

3. Giet uit in petrischalen en verwijder de luchtbellen.

4. Even aan de lucht drogen om een nat oppervlak te voorkomen.

oplossing A (basis):

bereiding:

1. Los de ingrediënten op in het water (indien nodig via verhitting).

2. Stel de pH, zodat deze na sterilisatie 7,0 ± 0,2 is.

3. Schenk het medium in daarvoor geschikte buizen/flessen.

4. Steriliseer in een autoclaaf (15 min. 121 ° C).

oplossing B (suiker/fenol rood oplossing):

bereiding:

1. Los de componenten op in ± 50 mI water.

2. Vul met water aan tot een eindvolume van 100 ml.

3. Verhit gedurende 20 min. in een waterbad van 70 ° C.

4. Koel af tot 47 ° C ± 1 ° C.

5. Gebruik de oplossing direct.

oplossing C (briljant groen oplossing):

bereiding:

1. Voeg het briljant groen (concentratie tussen 4,5 mg/l en 6 mg/l) toe aan het water.

2. Bewaar de oplossing tenminste 1 dag in het donker zodat auto-sterilisatie optreedt.

bereiding complete medium:

bereiding:

1. Voeg, onder aseptische omstandigheden, oplossing C toe aan de (tot 47 ° C ± 1 ° C) afgekoelde oplossing B.

2. Voeg deze oplossing toe aan oplossing A en meng het medium.

bereiding van de agar platen:

1. Giet het vers bereide medium in grote (± 40 ml) of in kleine petrischalen (±15 ml).

2. Laat de platen stollen.

3. Droog de platen voor gebruik.

oplossing A (basismedium):

bereiding:

1. Los de ingrediënten op in het water.

2. Stel de pH op 6,8 ± 0,2 bij 25 ° C en filtreer de oplossing.

3. Steriliseer de oplossing gedurende 15 min bij 121 ° C in een autoclaaf.

4. Laat de oplossing afkoelen tot 47 ° C.

oplossing B (ureumoplossing):

bereiding:

1. Los de ureum op in het water

2. Steriliseer de oplossing d.m.v. filtratie en controleer de steriliteit.

bereiding:

1. Voeg oplossing B (ureumoplossing) toe aan oplossing A (basismedium).

2. Verdeel het medium over steriele buizen, per buis 10 ml medium.

3. Laat de buizen stollen zodat een schuin gedeelte ontstaat.

samenstelling:

bereiding:

1. Los de ingrediënten op in het water (indien nodig d.m.v. verhitting).

2. Stel de pH, zodat deze na sterilisatie 7,4 ± 0,2 is.

3. Verdeel het medium over buizen, per buis 10 ml medium.

4. Steriliseer de oplossing gedurende 15 min bij 120 ° C in een autoclaaf.

5. Laat de buizen stollen zodat er bovenop 2,5 cm agar onderin de buis, een schuin gedeelte ontstaat.

samenstelling:

bereiding:

1. Los de ingrediënten op in het water (indien nodig d.m.v. verhitting).

2. Stel de pH, zodat deze na sterilisatie 6,8 ± 0,2 is.

3. Verdeel het medium over smalle reageerbuizen; per buis 5 mI medium.

4. Steriliseer in een autoclaaf (10 min. 121 ° C).

Deze bijlage beschrijft een methode voor de eerstelijnscontrole op de analyse van Salmonella met MSRV.

Om de kwaliteit van de geproduceerde media te bewaken, dient iedere dag een controle volgens onderstaand schema te worden uitgevoerd.

Dit protocol beschrijft een 24-uurs methode voor het aantonen van Salmonella met behulp van de PROBELIA^TM test (Bio-Rad Laboratories) in dons, faeces (mest), vellen en eindproduct afkomstig van pluimvee. De methode is gevalideerd ten opzichte van de door de branche opgestelde en door de Raad voor Accreditatie goedgekeurde analyse methode MSRV.

Salmonella : Salmonella spp. , d.w.z. alle typen Salmonella waarvan het DNA aan de hand van de Polymerase Chain Reactie (PCR) wordt aangetoond, wanneer wordt getest volgens de beschreven werkwijze.

Detectie van Salmonella : bepalen van de aan- of afwezigheid van deze micro-organismen als het onderzoek wordt uitgevoerd volgens de beschreven werkwijze.

Uit een voorophopingsmedium wordt, na voorincubatie, het DNA van Salmonella geïsoleerd. Vervolgens vindt amplificatie plaats van een voor Salmonella specifieke en gepatenteerde DNA- sequentie, het lagA gen, met behulp van de PCR. Het vermenigvuldigde DNA wordt na hybridisatie op een microtiterplaatstrip aangetoond middels een colorimetrische reactie. Inclusief voorophoping wordt een positieve of negatieve uitslag verkregen binnen 24 uur.

De PROBELIA^TMSalmonella test bestaat uit kant-en-klare reagentia, inclusief voorophopingmedium. Het te gebruiken gedestilleerde water moet van analysekwaliteit zijn.

De samenstelling en bereiding van media en kits is opgenomen in bijlage 1.

De gebruikelijke apparatuur voor een microbiologisch laboratorium en de voor de PROBELIA^TM test benodigde apparatuur en verbruiksmaterialen, zoals onderstaand vermeld:

Gesteriliseerde materialen voor éénmalig gebruik mogen worden toegepast.

1. 5.1

   Broedstoof voor het bebroeden bij 37 ± 1⁰ C

2. 5.2

   Micropipetten (5-50 en 20-200 μl)

3. 5.3

   Microcentrifuge voor 1,5 ml centrifugebuisjes (max. 10.000-15.000 rpm)

4. 5.4

   Verhittingsblokken of waterbaden ingesteld op 56± 1 °C en 100 ± 1 °C

5. 5.5

   Bio-Rad iCycler thermocycler voor PCR

6. 5.6

   Bio-Rad microtiterplaat shaker/incubator Model Stat-Fax

7. 5.7

   Bio-Rad microtiterplaat washer Model PW-40/41

8. 5.8

   Bio-Rad microtiterplat reader Model 550 met 450 nm en 620 nm filters

9. 5.9

   Stomacherzak met filter

10. 5.10

    Steriele centrifuge buisjes 1,5 ml

11. 5.11

    Steriele micropipetpunten met filter

12. 5.12

    Steriele PCR-tubes 200 μl

PCR technologie is zeer gevoelig: amplificatie van een enkel molecuul genereert miljoenen identieke kopieën van de gewenste sequentie. Deze kopieën kunnen via aërosolen in de laboratorium ruimte circuleren.

Om besmetting van nieuwe monsters met DNA sequenties vanuit amplificaties van voorgaande monsters te voorkòmen, is het essentiëel om de ruimtes waar de monster behandeling en het mixen van de reagentia plaatsvindt (pre-PCR ruimte) te scheiden van de ruimte waar de amplicon analyse plaatsvindt en de centrifugebuisjes worden geopend (post-PCR ruimte).

Het gebruik van de PROBELIA^TM PCR test vereist een minimum van 2 afgescheiden ruimtes. Elke ruimte is voorzien van eigen gebruiksmaterialen zoals pipetten, handschoenen, laboratorium jassen, etc., die niet mogen circuleren van de ene werkplek naar de andere.

Zie voor de acceptatie criteria voor monstermateriaal bijlage V.

De monsters dienen binnen 4 uur na ontvangst ingezet te worden. Indien de monsters echter binnen 48 uur op het laboratorium aanwezig zijn, mag gewacht worden met het inzetten van de monsters totdat maximaal 48 uur + 4 uur na de datum van monstername is verstreken.

Verdun het monster 1:10 in BPw in een stomacherzak met filter. Stomacher, en incubeer de BPw gedurende 18± 2 uur bij 37⁰ C ± 1⁰ C.

Bij verwerking van nekvel ten behoeve van de verdunning dient zo min mogelijk onderhuids vet meegesneden te worden; een overmaat vet kan de isolatie van DNA bemoeilijken en inhibitie van de PCR-reactie veroorzaken. Mest en dons vergen geen bijzondere voorbehandeling.

Na voorophoping wordt de inhoud van de stomacherzak lichtjes gehomogeniseerd middels voorzichtig zwenken. Vervolgens wordt met een steriele pipet (bij voorkeur met filter) 1 ml homogenaat uit de stomacherzak gepipetteerd in een 1,5 ml centrifuge buisje. Hierbij moeten geen vet, donsresten of andere vaste substanties worden meegepipetteerd.

Overige stappen worden uitgevoerd conform de gebruiksaanwijzing van de PROBELIA^TMSalmonella testkit (instructie van de fabrikant).

Resultaten worden beoordeeld conform de gebruiksaanwijzing van de PROBELIA^TMSalmonella testkit (instructie van de fabrikant). Deze zijn gebaseerd op bepaling van de optische densiteit (OD) verkregen op de Salmonella detectiestrip (H1), vergeleken met de OD van hetzelfde monster op de detectiestrip van de interne controle (H0). Zie ook onderstaande tabel:

In het geval van inhibitie van de amplificatiereactie (de OD’s voor monster en corresponderende interne controle zijn lager dan de gestelde cut-off value van 0.070) dient een nieuwe test te worden uitgevoerd. Hiertoe wordt het supernatant van het betreffende monster, verkregen na isolatie van DNA, 1:10 verdund met steriel water (instructie van de fabrikant). Vervolgens wordt de PCR opnieuw ingezet.

Voor een positief resultaat geldt: Salmonella aanwezig. Voor een negatief resultaat geldt: Salmonella afwezig. Verdere bevestiging van positieve uitslagen verkregen met de PROBELIA^TMSalmonella is ter beoordeling van de gebruiker maar is niet vereist.

Echter in die gevallen waarin volgens de Verordening Hygiënevoorschriften pluimveehouderij 1999 of de Verordening Hygiënevoorschriften pluimveeverwerkende industrie 1999 nadere serotypering van de Salmonella bevinding is vereist, dient met dezelfde BPw-voorophoping als waaruit de PCR is uitgevoerd alsnog een isolatie met MSRV en BGA uitgevoerd te worden, zie hiervoor de PVE branchemethode MSRV.

In bijlage IV is het werkvoorschrift voor serotypering van isolaten opgenomen.

De PROBELIA^TMSalmonella test kit bevat één positieve en twee negatieve controles. Een additionele interne controle in elk monster bepaald de efficiëntie van de PCR-reactie en is een indicator voor vals-negatieve reacties. Genoemde controles worden in elke test meegenomen.

De OD van de beide negatieve controles dient kleiner te zijn dan 0.050; deze waarde bevindt zich meestal tussen de 0.020 en 0.030. De OD van de positieve controle dient groter te zijn dan 2.000. De test is alleen geldig indien de optische densiteit van de controles voldoet aan bovengenoemde condities.

Voor de eerstelijnscontrole van de methode dienen te worden meegenomen:

1. Positieve controle

2. Negatieve controle (indien een ingangscontrole per batch wordt toegepast, kan deze negatieve controle komen te vervallen)

3. Blanco controle

Het resultaat wordt opgegeven als ‘aan- of afwezigheid van Salmonella in het betreffende monstermateriaal’ als Salmonella al dan niet is aangetoond volgens dit protocol.

Indien bij het aanleveren van de monsters door de opdrachtgever afwijkingen worden geconstateerd van de wijze waarop de monsters aangeleverd moeten worden, dan dient het laboratorium hierover schriftelijk een opmerking te maken richting de opdrachtgever (zie bijlage V).

Fach P., Dilasser F., Grout J., and Tache J., Evaluation of a polymerase chain reaction-based test for detecting Salmonella spp. in food samples: PROBELIA^TMSalmonella spp. Journal of Food Protection, Vol. 62 (12): 1387-1393 (1999).

Hartman E.G. Validatierapport van de isolatie van Salmonella uit de matrix pluimvee faeces m.b.v. het Modified Semi-solid Rappaport Vassiliadis (MSRV)-medium, Gezondheidsdienst voor Dieren, projectnr 401919, september 1999.

Miras I., Hermant N., Arricau N., Popoff M.Y. Nucleotide sequence of lagA and lagB genes involved in invasion of HeLa cells by Salmonella enterica subsp. Enterica ser. Typhy . Research in Microbiology, Vol. 146 (1): 17-20 (1995).

PROBELIA^TMSalmonella spp .: AFNOR certification, attest SDP-07/2-06/96.

Productschappen Vee, Vlees en Eieren, Verzamelband Actieplan Salmonella en Campylobacter in de pluimveevleessector 2000⁺ .

Van der Zee, H., et al. Vergelijking van de Salmonella bepaling met behulp van de conventionele branchemethode (MSRV) en een snelle alternatieve detectiemethode (PROBELIA^TM PCR) in de pluimveesector. PVE, september 2002.

Samenstelling:

Bereiding:

1. Los de ingrediënten op in het water (indien nodig d.m.v. verhitting)

2. Stel de pH, zodat deze na sterilisatie 7,2 ± 0,2 bedraagt bij 25⁰ C

3. Verdeel het medium over de daartoe geschikte flessen

4. Steriliseer in een autoclaaf (15 min. , 121⁰ C)

Samenstelling amplificatie kit

Samenstelling detectie kit:

Dit protocol beschrijft een 48-uurs methode voor het aantonen van Salmonella met behulp van de VIDAS SLM test (bioMérieux) in dons afkomstig van pluimvee. De methode is gevalideerd ten opzichte van de door de branche opgestelde en door de Raad voor Accreditatie goedgekeurde analyse methode MSRV.

Salmonella : Salmonella spp. , d.w.z. alle typen Salmonella waarvan zowel O als H antigenen met behulp van de Enzyme Linked Fluorescent Assay (ELFA) techniek worden aangetoond, wanneer wordt getest volgens de beschreven werkwijze.

Detectie van Salmonella : bepalen van de aan- of afwezigheid van deze micro-organismen als het onderzoek wordt uitgevoerd volgens de beschreven werkwijze.

VIDAS SLM is een enzym immunoassay voor detectie van Salmonella antigenen, waarbij gebruik wordt gemaakt van de ELFA methode en geautomatiseerd uitgevoerd op het VIDAS analyse apparaat.

De voorophoping en de selectieve ophopingen vinden achtereenvolgens plaats gedurende 18 uur in een voorophopingsmedium, 6-8 uur in 2 verschillende selectieve ophopingsmedia en als laatste gedurende 18 uur in een 3^e ophopingsmedium. Van dit laatste ophopingsmedium wordt een hoeveelheid verhit en in een reagens strip gebracht. De reagens strip wordt in het VIDAS analyse apparaat gebracht, waarna het aantonen van aanwezigheid van Salmonella antigenen met behulp van een cocktail van specifieke monoclonale antilichamen en een fluorescentie reactie volledig geautomatiseerd verloopt. Het test resultaat van deze aantoningsstap is na ca. 45 minuten beschikbaar.

Alle gebruikte grondstoffen en het gedestilleerde water moeten van analysekwaliteit zijn.

De samenstelling en bereiding van media en reagentia is opgenomen in bijlage 1 van de PVE Branchemethode MSRV. Er mag echter ook gebruik gemaakt worden van media die commercieel verkrijgbaar zijn.

De VIDAS SLM test bestaat uit kant-en-klare reagentia, zoals omschreven in de gebruiksaanwijzing van de VIDAS SLM 30 702 test, instructie van de fabrikant.

De gebruikelijke apparatuur voor een microbiologisch laboratorium en de voor de VIDAS SLM test benodigde apparatuur en verbruiksmaterialen, zoals onderstaand vermeld:

Gesteriliseerde materialen voor éénmalig gebruik mogen worden toegepast.

1. Broedstoof voor het bebroeden bij 37 ° C ± 1°C

2. Broedstoof voor het bebroeden bij 42 ° C ± 0,5°C

3. Micropipet (500 μl)

4. Steriele micropipetpunten

5. Waterbad (100⁰ C) of equivalent

6. Steriele entnaalden met een oog met een diameter van ca. 3 mm.

7. Steriele pipetten met een schaalverdeling van 0,1 ml en een meetvolume van 1 ml.

8. Petrischalen met een middellijn van ca. 9 cm.

9. Cultuurbuizen van 17/18 x 150 mm en van 8 x 160 mm.

10. Stomacherzakken (met filter)

11. VIDAS analyse apparaat

Zie voor de acceptatie criteria voor monstermateriaal bijlage V.

De monsters dienen binnen 4 uur na ontvangst ingezet te worden. Indien de monsters echter binnen 48 uur op het laboratorium aanwezig zijn, mag gewacht worden met het inzetten van de monsters totdat maximaal 48 uur + 4 uur na de datum van monstername is verstreken.

Verdun het monster 1:10 in BPw (25 gram dons in 225 ml BPw).

Stomacher, en incubeer de BPw 18 ± 2 uur bij 37 ° C ± 1 ° C.

Breng na incubatie van de BPw 1 ml van deze suspensie over in 10 ml SC bouillon. Incubeer 6-8 uur bij 37 ° C ± 1 ° C .

Breng tegelijkertijd ook 0,1 ml van deze BPw suspentie over in 10 ml RV bouillon. Incubeer 6-8 uur bij 42 ° C ± 0,5 ° C

Breng na incubatie van de SC bouillon 1 ml hiervan over in 10 ml M bouillon. Breng na incubatie van de RV bouillon 1 ml hiervan over in een 2^e buis met 10 ml M bouillon. Her-incubeer de SC bouillon en de RV bouillon voor nog eens 18 uur, om bevestiging achteraf mogelijk te maken. Incubeer de M bouillon buizen gedurende 18 uur bij 42 ° C ± 0,5 ° C.

Meng de M bouillon buizen na incubatie en breng uit elke buis 1 ml over in een eppendorfbuisje. Sluit de buisjes en verhit gedurende 15 minuten in een kokend waterbad. Voer vervolgens de VIDAS SLM test uit volgens de gebruiksaanwijzing van de fabrikant.

Bewaar de overgebleven bouillons bij 2-8 ° C voor bevestiging.

Resultaten worden beoordeeld conform de gebruiksaanwijzing van de VIDAS SLM test, gebruiksaanwijzing van de fabrikant. Deze zijn gebaseerd op metingen van de fluorescentie en worden gestandaardiseerd naar de zgn. Test Value. Resultaten met een Test Value onder de 0,23 betreffen monsters waarin Salmonella antigenen niet aantoonbaar waren. Resultaten met een test Value = 0,23 worden als Salmonella -positief gerapporteerd. Positieve resultaten moeten worden bevestigd met behulp van de bewaarde ophopings- en na-ophopingsmedia.

Ent met een öse vanuit de ophopingsbouillons (RV en SC) vanuit de broedstoven en vanuit de M bouillons vanuit de koeling af op gedroogde BGA platen. Incubeer deze platen gedurende 24 ± 2 uur bij 37 ° C ± 1 ° C.

Controleer de bebroede BGA-platen op de vorming van roze kolonies. Dergelijke kolonies worden als ‘vermoedelijk positief’ aangemerkt. Bevestiging van deze specifieke kolonies, zowel biochemisch als serologisch, vindt vervolgens plaats zoals omschreven in de PVE Branchemethode MSRV.

Voor donsmonsters vindt serotypering plaats voor de 4 hoofdgroepen van Salmonella (B, C, D en E) en indien van toepassing identificatie van Salmonella enteritidis en Salmonella typhimurium (indien bij de pluimveehouder het serotype nog niet bekend is). In bijlage IV is hiervoor het werkvoorschrift opgenomen.

De VIDAS SLM test kit bevat een positieve en een negatieve VIDAS reagens controle en een bijbehorende standaard. Deze worden meegenomen in de bepalingen zoals omschreven in de gebruiksaanwijzing van de VIDAS SLM test, instructie van de fabrikant.

Voor de eerstelijnscontrole van de methode dienen te worden meegenomen:

1. Positieve controle

2. Negatieve controle (indien een ingangscontrole per batch wordt toegepast, kan deze negatieve controle komen te vervallen)

3. Blanco controle

Geef het resultaat op als ‘aan- of afwezigheid van Salmonella in dons’, als Salmonella al dan niet is aangetoond volgens dit protocol.

Indien bij het aanleveren van de monsters door de opdrachtgever afwijkingen worden geconstateerd van de wijze waarop de monsters aangeleverd moeten worden, dan dient het laboratorium hierover schriftelijk een opmerking te maken richting de opdrachtgever (zie bijlage V).

Hartman, E.G., Validatierapport van de isolatie van Salmonella uit de matrix pluimvee faeces m.b.v. het Modified Semi-solid Rappaport Vassiliadis (MSRV)-medium, Gezondheidsdienst voor Dieren, projectnr. 401919, september 1999.

ISO 6579:1993(E). Microbiology. General guidance on methods for the detection of Salmonella .

Productschappen Vee, Vlees en Eieren, Verzamelband Actieplan Salmonella en Campylobacter in de pluimveevleessector 2000⁺ .

Van der Zee, H. et al. Validatierapport van de Salmonella bepaling in de matrix dons met behulp van de VIDAS SLM methode. PVE, september 2002.

Dit protocol beschrijft een methode voor het aantonen van thermotolerante Campylobacter spp. (in dit protocol verder als Campylobacter aangeduid) in pluimvee, verse pluimveeproducten en omgevingsmonsters zoals mestmonsters en blindedarm mestmonsters.

NEN-EN-ISO 6887-1:1999 , Microbiologie van voedingsmiddelen en diervoeders; Voorbereiding van het monster en bereiding van verdunningen door microbiologisch onderzoek; Deel 1: Algemene regels voor de bereiding van de primaire verdunning en verdere decimale verdunningen.

NEN-EN-ISO 6887-2:2002, Microbiologie van voedingsmiddelen en diervoeders; Voorbereiding van monsters en bereiding van verdunningen voor microbiologisch onderzoek; Deel 2: Specifieke werkwijze voor vlees en vleesproducten.

NEN-ISO 7218:1996, Microbiologie van voedingsmiddelen en diervoeders - Algemene regels voor microbiologische onderzoeken.

NVN-ENV-ISO 11133-1:2000, Microbiologie van voedingsmiddelen en diervoeders; Richtlijnen voor de kwaliteitsborging en productie van kweekmedia; Deel 1: Algemene richtlijnen voor kwaliteitsborging van de voorbereiding van kweekmedia in het laboratorium

Campylobacter : micro-organismen die de voor deze bacteriën karakteristieke groei vertonen en specifieke morfologische, biochemische en serologische reacties vertonen wanneer wordt gekweekt respectievelijk getest volgens de beschreven werkwijze.

Mestmonsters en blindedarm mestmonsters worden rechtstreeks geënt op een selectieve vaste voedingsbodem (mCCDA).

Pluimveeproducten (bijvoorbeeld vel van de borstkap of filet) worden in porties van 25 gram gedurende 1 minuut gestomacherd met 100 ml selectief ophopingsmedium (Preston). Hierna wordt het monstermateriaal verwijderd en alleen het ophopingsmedium gedurende 24 uur bebroed bij 41,5°C. Vervolgens wordt afgeënt op een selectieve vaste voedingsbodem (mCCDA).

Selectieve vaste voedingsbodems worden microaëroob gedurende 48 uur bij 41,5°C bebroed, waarna beoordeeld wordt op aanwezigheid van specifieke kolonies.

Specifieke kolonies worden bevestigd met behulp van oxidase reactie en microscopie. Als extra controle wordt een deel van de isolaten biochemisch en/of serologisch bevestigd.

Gebruik materialen die voldoende zuiver zijn.

Gebruik gedestilleerd of op een andere wijze gedemineraliseerd water. Het water mag geen voor micro-organismen giftige bestanddelen bevatten.

Voor een goede reproduceerbaarheid van de resultaten verdient het aanbeveling uit te gaan van in de handel verkrijgbare droge ingrediënten of geschikt bevonden droge voedingsmedia. De instructies van de fabrikant voor de bereiding moeten nauwgezet worden gevolgd.

Gebruik voor de meting van de pH een pH-meter; referentietemperatuur 25°C.

Indien het voedingsmedium niet direct wordt gebruikt, moet dit in het donker tussen 1°C en 5°C worden bewaard en onder omstandigheden waarbij geen veranderingen in de samenstelling optreden. Bewaar het voedingsmedium niet langer dan een maand, tenzij elders in dit protocol anders wordt aangegeven.

Er mag ook gebruik worden gemaakt van media die kant-en-klaar commercieel verkrijgbaar zijn.

Los de ingrediënten op in het water (indien nodig d.m.v. verhitting). Stel de pH zo in dat deze na sterilisatie 7,5 ± 0,2 bedraagt bij 25ºC. Steriliseer gedurende 15 minuten bij (121 ± 1)ºC.

OPMERKING

Deze antibiotica zijn ook tezamen verkrijgbaar als Preston supplement. Let op, ook het “vroeger” gebruikte Preston supplement, met cycloheximide in plaats van amphotericine-B, is nog steeds verkrijgbaar. De voorkeur wordt echter gegeven aan gebruik van supplement met amphotericine-B.

Los de antibiotica op in het water en steriliseer door middel van filtratie (0,22 μm filter)

Koel het basismedium af tot onder de 45ºC.

Voeg op aseptische wijze de antibiotica oplossing toe en meng zorgvuldig.

OPMERKING

In de originele beschrijving van Preston ophopingsmedium (en in daarop volgende beschrijvingen in bijvoorbeeld ISO) wordt paardenbloed gebruikt. In dit NEN voorschrift wordt echter geen paardenbloed toegepast, omdat uit recent onderzoek is gebleken dat dat voor onderhavige monstermatrix niet noodzakelijk is (Jacobs- Reitsma et al ., 2003).

Los de ingrediënten op in het water (indien nodig d.m.v. verhitting). Stel de pH zo in dat deze na sterilisatie 7,4 ± 0,2 bedraagt bij 25ºC. Steriliseer gedurende 15 minuten bij (121 ± 1)ºC.

OPMERKING

Deze antibiotica zijn ook tezamen verkrijgbaar als mCCDA supplement.

Los de antibiotica op in het water en steriliseer door middel van filtratie (0,22 μm filter)

Koel het basismedium af tot ongeveer 45ºC.

Voeg op aseptische wijze de antibiotica oplossing toe en meng zorgvuldig. Giet de agar uit in petrischalen met nok en laat stollen.

Los het N,N,N’,N’-tetramethyl-1,4-fenyleendiammoniumdihloride op in het water. Bereid het reagens vlak voor uitvoering van de oxidasetest.

Dit reagens is ook kant-en-klaar commercieel verkrijgbaar. Handel dan volgens de gebruiksaanwijzing van de fabrikant.

Llatexagglutinatietesten voor bevestiging van thermotolerante Campylobacter zijn commerciëel verkrijgbaar. Enkele leveranciers staan vermeld in Bijlage A.

Los de ingrediënten op in het water (indien nodig d.m.v. verhitting). Stel de pH zo in dat deze na sterilisatie 7,4 ± 0,2 is.

Verdeel het medium over geschikte reageerbuizen, 10 ml medium per buis.

Steriliseer gedurende 15 minuten bij (121 ± 1)ºC.

Laat de agar stollen, zodat er bovenop 2,5 cm agar onderin de buis, nog een schuin gedeelte ontstaat.

Gebruikelijke toestellen en steriel glaswerk voor microbiologische laboratoria (zie ook NEN-ISO 7218) en in het bijzonder de onderstaande:

OPMERKING

Gesteriliseerde materialen voor éénmalig gebruik mogen worden toegepast.

Broedstoof voor het bebroeden bij (41,5 ± 1) ° C.

Suspendeertoestel, Stomacher

Geschikte apparatuur en hulpmiddelen om te bebroeden in een micro-aërobe atmosfeer (ca. 6% zuurstof, 10% kooldioxide en 84% stikstof). Voor het verkrijgen van micro-aëroob milieu kan gebruik gemaakt worden van commerciële systemen (‘gas-zakjes’).

Microscoop, bij voorkeur met fase-contrast, vergroting 1000x.

Monstername is geen onderdeel van de methode zoals beschreven in deze norm. PVE heeft de procedure voor de monstername in een apart besluit vastgelegd.

Bederfelijke pluimveeproducten zoals borstvellen en filet dienen gekoeld (1-4°) te worden aangeleverd. Zie voor de acceptatie criteria voor monstermateriaal bijlage V. Indien bij het aanleveren van de monsters afwijkingen worden geconstateerd in de wijze waarop de monsters aangeleverd moeten worden, dan dient het laboratorium hierover schriftelijk een opmerking te maken richting opdrachtgever.

Campylobacter is zeer gevoelig voor invriezen en daarom is het invriezen van monsters niet toegestaan.

Monsters dienen binnen 48 uur na monstername te worden ingezet.

In alle gevallen geldt dat de agarplaten na beënten zonder uitstel onder micro-aërobe condities geïncubeerd dienen te worden, omdat Campylobacter obligaat micro-aërofiel is en onder andere omgevingscondities snel afsterft.

Monsters waarin hoge aantallen Campylobacter worden verwacht, zoals mest en blindedarm, worden rechtstreeks op het isolatiemedium afgestreken.

Maak 1 mengmonster van de 30 afzonderlijke blindedarmen door deze elk op steriele wijze open te knippen en uit elke darm een evenredige hoeveelheid materiaal over te brengen in een lege steriele petrischaal. Meng goed (bijvoorbeeld met een steriele swab of entoog).

Beënt vanuit het mengmonster met behulp van de swab of entoog een halve mCCDA-plaat. Beënt de rest van de plaat middels verdunningsstrepen met behulp van een steriele öse, zodanig dat na incubatie losliggende kolonies kunnen ontstaan.

Incubeer mCCDA platen micro-aëroob gedurende 48 (± 4) uur bij 41,5 (± 1)°C.

Breng 25 gram ± 1 gram van het monster, bijvoorbeeld een stuk huid van de borstkap of filet, in een stomacherzak en voeg 100 ml Preston bouillon toe. Stomacher gedurende 1 minuut en scheidt het monstermateriaal van de ophopingsbouillon (bijvoorbeeld door het verwijderen van de binnenzak van de stomacherzak met daarin het monstermateriaal of door overschenken van de ophopingsvloeistof in een schoon steriel flesje).

Incubeer de ophopingsbouillon (24 ± 2) uur bij (41,5 ± 1)°C in micro-aëroob milieu.

Indien geïncubeerd wordt in flesjes of (stomacher)-zakken met weinig kopruimte (d.w.z. = 2 cm), kan zonder eisen aan het milieu geïncubeerd worden.

Ent met behulp van een entoog (10 μl) de Preston-cultuur na incubatie uit op een mCCDA-plaat. Incubeer mCCDA platen micro-aëroob gedurende (48 ± 4) uur bij (41,5 ± 1)°C.

Beoordeel bebroede mCCDA-platen op de aanwezigheid van kolonies met de volgende morfologische eigenschappen: grijs, metalig, laag convex, amorf en de neiging om met de entstreep mee te groeien. Deze kolonies worden als ‘verdacht positief’ aangemerkt.

Voor de bevestiging uit met minimaal 1 tot maximaal 3 verdachte kolonies per plaat in geval van reincultuur en tot 5 verdachte kolonies (indien aanwezig) in geval van mengcultuur, totdat een positief resultaat wordt verkregen.

Ter bevestiging wordt een oxidase reactie uitgevoerd en worden de verdachte kolonies microscopisch beoordeeld.

Ent met een entoog (anders dan van nikkel/chroom) vanaf de mCCDA plaat een verdachte kolonie op een filtreerpapiertje bevochtigd met oxidasereagens. Lees na maximaal 10 seconden de reactie af. De reactie is positief bij paarskleuring en negatief indien er geen verkleuring optreedt.

Maak van de verdachte kolonie een hangende-druppel-preparaat of nat-preparaat en beoordeel met een fasecontrast of donkerveld microscoop (100x objectief) op de karakteristieke kurketrekker-vormige morfologie en grote beweeglijkheid van Campylobacter . Bij kleuring volgens Gram tonen Campylobacter bacteriën zich als kurketrekker-vormig gebogen Gram- negatieve staafjes. De karakteristieke vorm is ook goed te zien bij kleuring met Oost-Indische inkt. Bij oude culturen (> 2 dagen op plaat) kan Campylobacter coccoïde en minder beweeglijke vormen aannemen.

Bij twijfel of als extra controle op de juiste identificatie wordt aanbevolen om regelmatig een aanvullende bevestiging uit te voeren met een latexagglutinatietest of een TSI-buis, bijvoorbeeld met 1 op 50 bevestigde kolonies. Voer eerst een reinstrijk uit op bijvoorbeeld een bloedplaat of een mCCDA-basis agar plaat (zonder antibiotica supplement).

Latexagglutinatietesten zijn bij diverse firma’s commercieel verkrijgbaar (zie Bijlage A) en moeten volgens de gebruiksaanwijzing van de fabrikant worden ingezet en afgelezen.

Beënt een TSI buis middels ladderen van het schuin gestolde deel en middels steek-enten in de agar. Incubeer deze buis (24 ± 2) uur bij (41,5 ± 1)°C in micro-aëroob milieu. Beoordeel de reacties als weergegeven in tabel 1.

Campylobacter bacteriën vertonen de karakteristieken zoals omschreven in tabel 1.

* Indien het een Campylobacter coli betreft kan de buis toch enige zwarting te zien geven (dit species is namelijk beperkt in staat tot H₂S-vorming).

Geef het resultaat op als ‘aan- of afwezigheid van Campylobacter in het betreffende monstermateriaal’ als Campylobacter al dan niet is aangetoond volgens 8 (werkwijze).

Prestatiekenmerken zijn vooralsnog niet voorhanden.

Vermeld in het verslag:

1. de gevolgde methode;

2. de gegevens die noodzakelijk zijn voor de identificatie van het monster;

3. de gevolgde methode van monsterneming, indien bekend;

4. het resultaat volgens hoofdstuk 8;

5. eventuele bijzonderheden die tijdens de bepaling zijn waargenomen die het resultaat kunnen hebben beïnvloed.

NEN-EN ISO 10272.:1995 Microbiology of food and animal feeding stuffs - Horizontal method for the detection of thermotolerant Campylobacter + technical corrigenda (ISO10272:1995/Cor.1:1996(E) and ISO 10272:1995/Cor:1997(E).

Jacobs-Reitsma, W.F. (1994). Epidemiology of Campylobacter in Poultry. Thesis Agricultural University Wageningen, The Netherlands.

Jacobs-Reitsma W., M. van der Wal, R. Achterberg and J. Wagenaar. Comparative studies on Campylobacter isolation methods from fresh poultry products. Posterpresentation at the 12th International Workshop on Campylobacter, Helicobacter and Related Organisms, september 2003, Aarhus, Denmark.

PVE Branchemethode (MSRV) voor het aantonen van Salmonella in dons, faeces, vellen en eindproduct afkomstig van pluimvee (inclusief 5 bijlagen), d.d. 20-07-01 Vb. Bo. nr. 31.

Beschikbare latex agglutinatie testen voor bevestiging van thermotolerante Campylobacter zijn onder andere:

DryspotCampylobacterTest , Oxoid DR 150M Oxoid ltd., Basingstoke Hampshire, England

INDX® - Campy (jcl)™ 50 test kit Catalog # 2200-01-50

(voorheen Meritec™-Campy (jcl), #203050, Meridian Diagnostics)

Integrated Diagnostics, Inc.

Baltimore, MD 21227 USA

Microscreen ®Campylobacter , M46

Microgen Bioproducts Ltd. (voorheen Mercia Diagnostics)

1, Admiralty Way, Camberley, Surrey GU15 3DT, UK

Voor de eerstelijnscontrole van de methode dienen te worden meegenomen:

Indien op het laboratorium monsters eindproduct worden opgehoopt in Preston bouillon, dan wordt een ongeënte Preston-buis (of -zakje) gebruikt als blanco controle. Deze controle buis wordt afgeënt op een mCCDA-plaat. Na incubatie volgens de beschreven procedure mag er geen groei zijn op de mCCDA-plaat.

Indien een hoeveelheid (blindedarm)mest direct met behulp van een swab wordt geënt op een mCCDA-plaat, dan wordt een onbeënte mCCDA-plaat gebruikt als blanco controle. Na incubatie volgens de beschreven procedure mag er geen groei zijn op deze mCCDA-plaat.

Hiervoor wordt gebruik gemaakt van een referentiestam van C. jejuni . (bijvoorbeeld ATCC 29428).

Indien op het laboratorium monsters eindproduct worden ingezet, dan wordt een Preston-buis (of -zakje) aangeënt met de referentiestam en gebruikt als positieve controle. Deze positieve controle buis wordt afgeënt op een mCCDA-plaat. Na incubatie volgens de beschreven procedure moet op de mCCDA-plaat groei te zien zijn met de typische morfologische kenmerken.

Indien op het laboratorium monsters (blindedarm)mest worden ingezet, dan wordt een mCCDA- plaat aangeënt met de referentiestam en gebruikt als positieve controle. Na incubatie volgens de beschreven procedure moet op de mCCDA-plaat groei te zien zijn met de typische morfologische kenmerken.

Tevens kan deze referentiestam gebruikt worden als positieve controle bij de uitvoering van de oxidase test, de microscopie en eventueel de agglutinatie test en/of TSI-buis.

Voor de ingangscontrole van een batch dienen te worden meegenomen:

1. Positieve controle

   zie boven

2. Negatieve controle

Hiervoor wordt gebruik gemaakt van een referentiestam van E. coli (bijvoorbeeld ATCC 25922). Deze controlestam mag op een mCCDA-plaat geen ‘verdachte’ kolonies te zien geven.

Indien geen ingangscontrole wordt uitgevoerd, maar alleen eerstelijnscontrole, dan moet bij deze eerstelijnscontrole altijd een blanco, een positieve én een negatieve controle meegenomen worden.

Alleen indien de controles een juiste uitslag geven mag de uitslag van de monsters afgegeven worden.

Dit protocol beschrijft een methode voor het aantonen van thermotolerante Campylobacter spp. (in dit protocol verder als Campylobacter aangeduid) in verse pluimveeproducten. De methode is gevalideerd ten opzichte van de door de branche opgestelde en door de Raad voor Accreditatie goedgekeurde analyse methode.

NEN-EN-ISO 6887-1:1999 , Microbiologie van voedingsmiddelen en diervoeders; Voorbereiding van het monster en bereiding van verdunningen door microbiologisch onderzoek; Deel 1: Algemene regels voor de bereiding van de primaire verdunning en verdere decimale verdunningen.

NEN-EN-ISO 6887-2:2002, Microbiologie van voedingsmiddelen en diervoeders; Voorbereiding van monsters en bereiding van verdunningen voor microbiologisch onderzoek; Deel 2: Specifieke werkwijze voor vlees en vleesproducten.

NEN-ISO 7218:1996, Microbiologie van voedingsmiddelen en diervoeders - Algemene regels voor microbiologische onderzoeken.

NVN-ENV-ISO 11133-1:2000, Microbiologie van voedingsmiddelen en diervoeders; Richtlijnen voor de kwaliteitsborging en productie van kweekmedia; Deel 1: Algemene richtlijnen voor kwaliteitsborging van de voorbereiding van kweekmedia in het laboratorium

Campylobacter : Campylobacter spp., dat wil zeggen alle typen Campylobacter waarvan de specifieke antigenen met behulp van de Enzyme Linked Fluorescent Assay (ELFA) techniek worden aangetoond, wanneer wordt getest volgens de beschreven werkwijze.

Door de selectieve ophoping te incuberen bij 41,5 ± 1º C wordt geselecteerd op alleen de thermotolerante Campylobacter species.

Detectie van Campylobacter : bepalen van de aan- of afwezigheid van deze micro- organismen als het onderzoek wordt uitgevoerd volgens de beschreven werkwijze.

VIDAS CAM is een enzym immunoassay voor de detectie van Campylobacter antigenen, waarbij gebruik wordt gemaakt van de ELFA methode en die geautomatiseerd wordt uitgevoerd op het VIDAS analyse apparaat.

Pluimveeproducten (bijvoorbeeld vel van de borstkap of filet) worden in porties van 25 gram gedurende 1 minuut gestomacherd met 100 ml selectief ophopingsmedium (Preston). Hierna wordt het monstermateriaal verwijderd en alleen het ophopingsmedium gedurende 48 uur bebroed bij 41,5°C. Vervolgens wordt de VIDAS CAM assay uitgevoerd. Het test resultaat van deze aantoningsstap is na ca. 70 minuten beschikbaar. Verdere bevestiging van positieve uitslagen is niet noodzakelijk.

Gebruik materialen die voldoende zuiver zijn.

Gebruik gedestilleerd of op een andere wijze gedemineraliseerd water. Het water mag geen voor micro-organismen giftige bestanddelen bevatten.

Voor een goede reproduceerbaarheid van de resultaten verdient het aanbeveling uit te gaan van in de handel verkrijgbare droge ingrediënten of geschikt bevonden droge voedingsmedia. De instructies van de fabrikant voor de bereiding moeten nauwgezet worden gevolgd.

Gebruik voor de meting van de pH een pH-meter; referentietemperatuur 25°C.

Indien het voedingsmedium niet direct wordt gebruikt, moet dit in het donker tussen 1°C en 5°C worden bewaard en onder omstandigheden waarbij geen veranderingen in de samenstelling optreden. Bewaar het voedingsmedium niet langer dan een maand, tenzij elders in dit protocol anders wordt aangegeven.

Er mag ook gebruik worden gemaakt van media die kant-en-klaar commercieel verkrijgbaar zijn.

Los de ingrediënten op in het water (indien nodig d.m.v. verhitting). Stel de pH zo in dat deze na sterilisatie 7,5 ± 0,2 bedraagt bij 25ºC. Steriliseer gedurende 15 minuten bij (121 ± 1)ºC.

Los de antibiotica op in het water en steriliseer door middel van filtratie (0,22 μm filter).

Koel het basismedium af tot onder de 45ºC.

Voeg op aseptische wijze de antibiotica oplossing toe en meng zorgvuldig.

OPMERKING

In de originele beschrijving van Preston ophopingsmedium (en in daarop volgende beschrijvingen in bijvoorbeeld ISO) wordt paardenbloed gebruikt. In dit NEN voorschrift wordt echter geen paardenbloed toegepast, omdat uit recent onderzoek is gebleken dat dat voor onderhavige monstermatrix niet noodzakelijk is (Jacobs-Reitsma et al ., 2003).

Gebruikelijke toestellen en steriel glaswerk voor microbiologische laboratoria (zie ook NEN- ISO 7218) en in het bijzonder de onderstaande:

OPMERKING

Gesteriliseerde materialen voor éénmalig gebruik mogen worden toegepast.

Broedstoof voor het bebroeden bij (41,5 ± 1) ° C.

Suspendeertoestel, Stomacher

Geschikte apparatuur en hulpmiddelen om te bebroeden in een micro-aërobe atmosfeer (ca. 6% zuurstof, 10% kooldioxide en 84% stikstof). Voor het verkrijgen van micro-aëroob milieu kan gebruik gemaakt worden van commerciële systemen (‘gas- zakjes’), bijvoorbeeld:

GenBox micro-aërofiel (10 zakjes, ref. 96125, bioMérieux).

VIDAS of mini VIDAS analyser (bioMérieux).

VIDAS CAM assay (30 testen, ref. 30111, bioMérieux)

Monstername is geen onderdeel van de methode zoals beschreven in deze norm. PVE heeft de procedure voor de monstername in een apart besluit vastgelegd.

Bederfelijke pluimveeproducten zoals borstvellen en filet dienen gekoeld (1-4° C) te worden aangeleverd. Zie voor de acceptatie criteria voor monstermateriaal bijlage IX van het gewijzigde Besluit Protocollen Hygiënevoorschriften Pluimveehouderij (PVE, 2004-I). Indien bij het aanleveren van de monsters afwijkingen worden geconstateerd in de wijze waarop de monsters aangeleverd moeten worden, dan dient het laboratorium hierover schriftelijk een opmerking te maken richting opdrachtgever.

Campylobacter is zeer gevoelig voor invriezen en daarom is het invriezen van monsters niet toegestaan.

Monsters dienen binnen 48 uur na monstername te worden ingezet.

Breng 25 gram ± 1 gram van het monster, bijvoorbeeld een stuk huid van de borstkap of filet, in een stomacherzak en voeg 100 ml Preston bouillon toe. Stomacher gedurende 1 minuut en scheidt het monstermateriaal van de ophopingsbouillon (bijvoorbeeld door het verwijderen van de binnenzak van de stomacherzak met daarin het monstermateriaal of door overschenken van de ophopingsvloeistof in een schoon steriel flesje).

Incubeer de ophopingsbouillon (48 ± 2) uur bij (41,5 ± 1)°C in micro-aëroob milieu.

Indien geïncubeerd wordt in flesjes of (stomacher)-zakken met weinig kopruimte (d.w.z. = 2 cm), kan zonder eisen aan het milieu geïncubeerd worden.

OPMERKING

In tegenstelling tot de branchemethode is de incubatietijd in dit voorschrift 48 uur.

Meng het ophopingsmedium na incubatie en breng 2 ml over in een eppendorfbuisje. Sluit de buisjes en verhit gedurende 15 minuten in een kokend waterbad. Voer vervolgens de VIDAS CAM test uit volgens de gebruiksaanwijzing. Runtime VIDAS CAM test bedraagt ongeveer 70 minuten.

OPMERKING

Indien de VIDAS CAM test niet direct kan worden uitgevoerd is het mogelijk de ophoping (of een deel ervan) in te vriezen voor maximaal 48 uur. Na ontdooien moet de ophoping opgekookt worden en kan bovenstaande werkwijze worden gevolgd.

Resultaten worden beoordeeld conform de gebruiksaanwijzing van de VIDAS CAM test. Deze zijn gebaseerd op metingen van de fluorescentie en worden gestandaardiseerd naar een zogenaamde Test Value (TV). Resultaten met een TV onder de 0,1 betreffen monsters waarin Campylobacter antigenen niet aantoonbaar waren. Resultaten met een TV = 0,1 worden als Campylobacter -positief gerapporteerd.

De in dit voorschrift beschreven VIDAS CAM methode is een detectie methode. Verdere confirmaties zijn niet nodig.

De VIDAS CAM test kit bevat een positieve en een negatieve VIDAS reagens controle en een bijbehorende standaard. Deze worden meegenomen in de bepalingen zoals omschreven in de gebruiksaanwijzing van de VIDAS CAM test.

Voor de eerstelijnscontrole van de methode dienen te worden meegenomen [bijlage ]:

1. Blanco controle

2. Positieve controle

3. Negatieve controle (indien een ingangscontrole per batch wordt toegepast, kan deze negatieve controle komen te vervallen)

Geef het resultaat op als ‘aan- of afwezigheid van Campylobacter in het betreffende monstermateriaal’ als Campylobacter al dan niet is aangetoond volgens 8 (werkwijze).

Prestatiekenmerken zijn vooralsnog niet voorhanden.

Vermeld in het verslag:

1. de gevolgde methode;

2. de gegevens die noodzakelijk zijn voor de identificatie van het monster;

3. de gevolgde methode van monsterneming, indien bekend;

4. het resultaat volgens hoofdstuk 8;

5. eventuele bijzonderheden die tijdens de bepaling zijn waargenomen die het resultaat kunnen hebben beïnvloed.

PVE Branchemethode voor het aantonen van thermotolerante Campylobacter. Bijlage VI van het Besluit tot wijziging van het besluit protocollen hygiënevoorschriften pluimveehouderij 1999 (2004-I) (Verordeningenblad Bedrijfsorganisaties).

PVE Acceptatie criteria, Opmerkingen opdrachtgever bij aanleveren afwijkende monsters, Bijlage IX van het Besluit tot wijziging van het besluit protocollen hygiënevoorschriften pluimveehouderij 1999 (2004-I) (Verordeningenblad Bedrijfsorganisaties).

Jacobs-Reitsma, W., M. van der Wal, E. Samuëls and J. Wagenaar. Evaluation of the VIDAS Campylobacter Assay for detection of Campylobacter in fresh poultry products after various enrichment methods. Posterpresentation A-18 at 12th International Workshop on Campylobacter, Helicobacter and Related Organisms, september 2003, Aarhus, Denmark. International Journal of Medical Microbiology, Vol. 293 Suppl. 35, p. 6.

Jacobs-Reitsma, W., M. van der Wal, R. Achterberg, J. Wagenaar. Comparative studies on Campylobacter isolation methods from fresh poultry products. Posterpresentation A-21 at 12th International Workshop on Campylobacter, Helicobacter and Related Organisms, september 2003, Aarhus, Denmark. Ìnternational Journal of Medical Microbiology, Vol. 293 Suppl. 35, p. 6-7.

Samuëls, E.L.A.M. en W. Jacobs-Reitsma, Validatierapport van de Campylobacter bepaling in de matrix pluimveevlees met behulp van de VIDAS CAM methode. (Onderzoek in het kader van het PVE Plan van Aanpak/Actieplan 2000+ Salmonella en Campylobacter in de pluimveesector), april 2004.

1. 1.

   Eerstelijnscontrole van de methode

Voor de eerstelijnscontrole van de methode dienen te worden meegenomen:

Indien op het laboratorium monsters eindproduct worden opgehoopt in Preston bouillon, dan wordt een ongeënte Preston-buis (of -zakje) gebruikt als blanco controle. Deze controle wordt getest met de VIDAS CAM test en dient negatief te zijn

Hiervoor wordt gebruik gemaakt van een referentiestam van C. jejuni (bijvoorbeeld ATCC 29428).

Indien op het laboratorium monsters eindproduct worden ingezet, dan wordt een Preston- buis (of -zakje) aangeënt met de referentiestam en gebruikt als positieve controle. Deze positieve controle wordt getest met de VIDAS CAM test en dient positief te zijn

Voor de ingangscontrole van een batch dienen te worden meegenomen:

1. Positieve controle zie boven

2. Negatieve controle

Hiervoor wordt gebruik gemaakt van een referentiestam van E. coli (bijvoorbeeld ATCC 25922). Deze negatieve controlestam wordt getest met de VIDAS CAM test en dient negatief te zijn.

Indien geen ingangscontrole wordt uitgevoerd, maar alleen eerstelijnscontrole, dan moet bij deze eerstelijnscontrole altijd een blanco, een positieve én een negatieve controle meegenomen worden.

Alleen indien de controles een juiste uitslag geven mag de uitslag van de monsters afgegeven worden.

Dit protocol beschrijft een 24-uurs methode voor het aantonen van Salmonella met behulp van de iQ Check™ Salmonella kit (Bio-Rad Laboratories b.v.) in dons, mest en vlees afkomstig van pluimvee. De methode is gevalideerd ten opzichte van de door de branche opgestelde en door de Raad voor Accreditatie goedgekeurde analyse methode MSRV dan wel analyse methode Probelia™.

Salmonella: Salmonella spp., d.w.z. alle typen Salmonella waarvan het DNA aan de hand van de Polymerase Chain Reactie (PCR) wordt aangetoond, wanneer wordt getest volgens de beschreven werkwijze.

Uit een voorophopingsmedium wordt, na voorincubatie, het DNA van Salmonella geïsoleerd. Met behulp van de real-time polymerase chain reaction (PCR) worden Salmonella -specifieke DNA sequenties gelijktijdig vermenigvuldigd en gedetecteerd middels fluorescente probes. Inclusief voorophoping wordt een positieve of negatieve uitslag verkregen binnen 24 uur.

1. 1.

   Niet-selectief voorophopingsmedium

   gebufferd pepton water (BPw)	Bio-Rad code 356-4684 (500 g) of Bio-Rad code 355-4170 (225 ml)
   iQ Check™ Salmonella kit	Bio-Rad code 35 7-8100

De iQ Check™ Salmonella kit bestaat uit kant-en-klare reagentia.

De samenstelling en bereiding van medium en kit is opgenomen in resp. bijlage 1 en bijlage 2.

De gebruikelijke apparatuur voor een moleculair/microbiologisch laboratorium en de voor de iQ Check™ Salmonella test benodigde apparatuur en verbruiksmaterialen, zoals onderstaand vermeld:

1. 5.1

   iCycler Thermal Cycler met 96-wells reactiemodule (Bio-Rad cat. #: 170-8720)

2. 5.2

   iCycler iQ Optical Module (Bio-Rad cat. #: 170-8740)

3. 5.3

   iCycler iQ Filter set Texas Red/ Rox Dyes (Bio-Rad cat. #: 170-8781)

4. 5.4

   Stomacher

5. 5.5

   Broedstoof voor het bebroeden bij 37 ± 1°C

6. 5.6

   Verhittingsblok voor 1,5 ml buizen (100 ± 1°C)

7. 5.7

   Tafelcentrifuge (maximaal 12.000 rpm, voor 1,5 ml buizen)

8. 5.8

   Vortex

9. 5.9

   Magnetische roerder

10. 5.10

    20 μl, 200 μl and 1000 μl micropipetten

11. 5.11

    Combi-tips pipetten

Opmerking: Het gebruik van een universal power source (UPS) in combinatie met de iCycler iQTM wordt aanbevolen.

1. 5.12

   iCycler iQ 96-well PCR platen (Bio-Rad cat. #: 223-9441)

2. 5.13

   iCycler iQ Optical sealing tape (Bio-Rad cat. #: 223-9444)

3. 5.14

   200 ml 8-strip tubes (Bio-Rad cat. #: 223-9469)

4. 5.15

   200 ml 8-strip caps for 200 μl tubes (Bio-Rad cat. #: 223-9472)

5. 5.16

   Stomacher zakken met filter

6. 5.17

   1 ml en 10 ml pipetten

7. 5.18

   Steriele filtertips, passend op 20 μl, 200 μl en 1000 μl micropipetten

8. 5.19

   1,5 ml Eppendorf SafeLock buisjes

9. 5.20

   Combi-tips tips, steriel, individueel verpakt

10. 5.21

    2 ml and 5 ml steriele buizen of flesjes

11. 5.22

    Poeder-vrije handschoenen

12. 5.23

    Milli-Q of gedestilleerd steriel water

13. 5.24

    Ethanol 96% of NaOH 5%

Opmerking: Gesteriliseerde materialen voor éénmalig gebruik mogen worden toegepast.

De test dient te worden uitgevoerd door op juiste wijze getraind personeel.

Monsters en kweken dienen te worden behandeld en afgevoerd als potentieel infectieus materiaal.

De kwaliteit van de resultaten is afhankelijk van een strikte uitvoering conform Good Laboratory Practice, in het bijzonder aangaande PCR:

1. Gebruik specifieke, gescheiden sets laboratorium benodigdheden zoals pipetten en buizen voor bijvoorbeeld DNA extractie en de bereiding van PCR mix.

2. Het is van groot belang dat gebruik wordt gemaakt van een positieve en negatieve controle in elke serie van amplificatie reacties ('PCR run').

3. Gebruik geen reagentia waarvan de houdbaarheidsdatum is verstreken.

4. Homogeniseer reagentia voorafgaand aan gebruik.

5. Controleer regelmatig de nauwkeurigheid en precisie van alle pipetten en apparatuur.

6. Verwissel handschoenen met enige regelmaat, vooral indien contaminatie wordt verondersteld.

7. Voer periodieke reiniging uit van de werkplaats met tenminste 5% bleekmiddel.

8. Vermijdt gebruik van latex handschoenen met poeder. Voorkom vingerafdrukken op het optisch sealing tape.

9. Schrijf niet op de dopjes van PCR-buizen. In beide gevallen zal de real-time data- acquisitie hinder ondervinden.

Zie voor de acceptatie criteria voor monstermateriaal bijlage V van Besluit Protocollen Hygiënevoorschriften Pluimveeverwerkende industrie 1999 (PPE, 2004-II).

De monsters dienen binnen 4 uur na ontvangst ingezet te worden. Indien de monsters echter binnen 48 uur op het laboratorium aanwezig zijn, mag gewacht worden met het inzetten van de monsters totdat maximaal 48 uur + 4 uur na de datum van monstername is verstreken.

1. Homogenizeer 25 g monster in 225 ml gebufferd pepton water, in een stomacher zak met filter.

2. Incubeer zonder schudden gedurende 18-20 uur bij 37 °C.

Opmerking: Bij verwerking van borstvel ten behoeve van de verdunning dient zo min mogelijk onderhuids vet meegesneden te worden; een overmaat vet kan de isolatie van DNA bemoeilijken en inhibitie van de PCR-reactie veroorzaken. Mest en dons vergen geen bijzondere voorbehandeling.

1. Pipetteer 1 ml ophoping met een disposable pipet in een 1,5 ml Eppendorf buis (voorkom pipetteren van grote fragmenten van monsterresten). Schudt de ophoping niet voorafgaand aan het pipetteren van het monster.

De overige stappen voor de DNA extractie worden uitgevoerd zoals omschreven in de gebruiksaanwijzing van de iQ Check™ Salmonella testkit (Bio-Rad, 2004).

Opmerking : In geval van ophopingen met een vettig supernatant, neem het monster juist onder deze vetlaag.

Apparatuur en software gebruik, uitvoering PCR en data analyse worden allen uitgevoerd zoals omschreven in de gebruiksaanwijzing van de iQ Check™ Salmonella testkit (Bio-Rad, 2004).

Resultaten worden geïnterpreteerd middels analyse van de Ct-waarden (threshold cycle) van elk monster.

Een positief Salmonella monster dient een Ct-waarde = 10 voor de FAM fluorophore te hebben. Indien de Ct-waarde lager dan 10 is, dient het verloop van de amplifïcatiecurve gecontroleerd te worden via de "Background subtracted" mode; de curve dient een vlakke basislijn te vertonen, gevolgd door een geleidelijke toename van fluorescentie. Indien de curve correct is, kan het monster positief voor Salmonella worden bevonden.

Indien geen Ct-waarde (Ct=N/A) voor FAM is toegekend aan een monster, of de curve een niet- kenmerkend verloop vertoont, moet de interne controle van dat monster worden geanalyseerd. Wanneer geen Ct-waarde (Ct=N/A) wordt verkregen voor FAM, dan is de uiteindelijke interpretatie van het resultaat afhankelijk van de interne controle:

1. Een monster wordt negatief beschouwd voor Salmonella indien geen Ct-waarde voor FAM is toegekend, en de interne controle (Texas Red) een Ct-waarde > 10 heeft.

2. Indien de interne controle ook geen Ct-waarde is toegekend (Ct = N/A), dan is interpretatie van het resultaat onmogelijk. Een dergelijk resultaat kan een indicatie zijn van remming van de PCR reactie. In dit geval dient het monster (DNA-extract) 1/10 verdund te worden in steriel gedestilleerd water en moet de PCR reactie worden herhaald.

Interpretatie van monsterresultaten:

Voor een positief resultaat geldt: Salmonella aangetoond. Voor een negatief resultaat geldt: Salmonella niet aangetoond.

Verdere bevestiging van positieve uitslagen verkregen met de iQ Check™ Salmonella test is ter beoordeling van de gebruiker maar is niet vereist.

Echter in die gevallen waarin volgens het Plan van Aanpak/Actieplan 2000⁺ nadere serotypering van de Salmonella bevinding is vereist, dient met dezelfde BPw-voorophoping als waaruit de PCR is uitgevoerd alsnog een isolatie met MSRV en BGA uitgevoerd te worden (PVE Branche methode MSRV, PPE, 2004-II).

In bijlage IV van Besluit Protocollen Hygiënevoorschriften Pluimveeverwerkende industrie 1999, wijziging 2004-II, is het werkvoorschrift voor serotypering van isolaten opgenomen (PPE 2004-II).

De iQ Check™ Salmonella test kit bevat een positieve en een negatieve controle. Een additionele interne controle in elk monster bepaald de efficiëntie van de PCR-reactie en is een indicator voor vals-negatieve reacties. Genoemde controles worden in elke test meegenomen.

Ten behoeve van de validatie van het gehele experiment dienen de controles te voldoen aan de volgende eisen, weergegeven in onderstaande tabel. Is dit niet het geval, dan moet de PCR reactie worden herhaald.

Voor de eerstelijnscontrole van de methode als geheel dienen te worden meegenomen:

1. Positieve controle

2. Negatieve controle (indien een ingangscontrole per batch wordt toegepast, kan deze negatieve controle komen te vervallen)

3. Blanco controle

Het resultaat wordt opgegeven als 'Salmonella aangetoond dan wel niet aangetoond in het betreffende monstermateriaal' als Salmonella al dan niet is aangetoond volgens dit protocol.

Indien bij het aanleveren van de monsters door de opdrachtgever afwijkingen worden geconstateerd van de wijze waarop de monsters aangeleverd moeten worden, dan dient het laboratorium hierover schriftelijk een opmerking te maken richting de opdrachtgever (zie bijlage V van Besluit Protocollen Hygiënevoorschriften Pluimveeverwerkende industrie 1999, wijziging 2004-II (PPE, 2004-II).

AFNOR Validation Certificate, iQ Check™ Salmonella, attest BRD-07/06-07/04.

Bio-Rad Laboratories b.v., Gebruiksaanwijzing van de iQ Check™ Salmonella Test. 30 augustus 2004, Veenendaal, NL.

European Standard NF EN ISO 6579. Microbiology of food and animal feeding stuffs - Horizontal method for the detection of Salmonella spp. December 2002.

Miras L, Hermant N., Arricau N., Popoff M.Y. Nucleotide sequence of lagA and lagB genes involved in invasion of HeLa cells by Salmonella enterica subsp. Enterica ser. Typhy. Research in Microbiology, Vol. 146 (1): 17-20 (1995).

Productschap Pluimvee en eieren (PPE). Verzamelband Actieplan Salmonella en Campylobacter in de pluimveevleessecor 2000+ (zie ook: www.pve.nl) .

Productschap Pluimvee en eieren (PPE). Opmerkingen opdrachtgever bij aanleveren afwijkende monsters, Acceptatiecriteria. Bijlage V bij Besluit Protocollen Hygiënevoorschriften Pluimveeverwerkende industrie 1999, wijziging 2004-II (d.d. 09-09-2004). Vb. Bo. Nr. 61, d.d. 08-10-2004. (ook via: www.pve.nl)

Productschap Pluimvee en eieren (PPE). PVE Branche methode MSRV voor het aantonen van Salmonella in dons, faeces, vellen en eindproduct afkomstig van pluimvee. Bijlage II bij Besluit Protocollen Hygiënevoorschriften Pluimveeverwerkende industrie 1999, wijziging 2004-II (d.d. 09-09-2004). Vb. Bo. Nr. 61, d.d. 08-10-2004. (ook via: www.pve.nl)

Productschap Pluimvee en eieren (PPE). Serologische bevestiging en serotypering. Bijlage IV bij Besluit Protocollen Hygiënevoorschriften Pluimveeverwerkende industrie 1999, wijziging 2004-II (d.d. 09-09-2004). Vb. Bo. Nr. 61, d.d. 08-10-2004. (ook via: www.pve.nl)

Tyagi, S. and Kramer, F.R. Molecular Beacons: Probes that fluoresce upon hybridization. Nature Biotechnology 14: 303-308 (1996).

1. 1.

   Samenstelling van het voorophopingsmedium

2. 2.

   Samenstelling iQ Check™ Salmonella test kit

Voorophopingsmedium: Gebufferd pepton water (BPw)

Samenstelling:

Bereiding:

1. Los de ingrediënten op in het water (indien nodig d.m.v. verhitting)

2. Stel de pH, zodat deze na sterilisatie 7,2 ± 0,2 bedraagt bij 25 °C

3. Verdeel het medium over de daartoe geschikte flessen

4. Steriliseer in een autoclaaf (15 minuten, 121 °C)

Samenstelling

De iQ-Check™ Salmonella kit bevat reagentia ten behoeve van 96 testen.

Het laboratorium bepaalt of Salmonella aan- dan wel afwezig is. Indien Salmonella is aangetoond dan is de uitslag ‘aanwezigheid van Salmonella in inlegvellen’.

Cloacaswabs 4 weken:

Het laboratorium bepaalt of Salmonella aan- dan wel afwezig is. Indien Salmonella is aangetoond dan is de uitslag ‘aanwezigheid van Salmonella in swabs’.

Het laboratorium bepaalt of Salmonella aan- dan wel afwezig is. Indien Salmonella is aangetoond dan is de uitslag ‘aanwezigheid van Salmonella in swabs’.

Het laboratorium bepaalt of Salmonella aan- dan wel afwezig is. Indien Salmonella is aangetoond dan is de uitslag ‘aanwezigheid van Salmonella in dons’.

Swabs:

Het laboratorium bepaalt of Salmonella aan- dan wel afwezig is. Indien Salmonella is aangetoond dan is de uitslag ‘aanwezigheid van Salmonella in swabs’.

Overschoentjes:

Het laboratorium bepaalt of Salmonella aan- dan wel afwezig is. Indien Salmonella is aangetoond dan is de uitslag ‘aanwezigheid van Salmonella in overschoentjes’.

Het laboratorium bepaalt of Salmonella aan- dan wel afwezig is. Indien Salmonella is aangetoond dan is de uitslag ‘aanwezigheid van Salmonella in blindedarmmest’.

Het laboratorium bepaalt of Salmonella aan- dan wel afwezig is. Indien Salmonella is aangetoond dan is de uitslag ‘aanwezigheid van Salmonella in vellen’.

Het laboratorium bepaalt of Salmonella aan- dan wel afwezig is. Indien Salmonella is aangetoond dan is de uitslag ‘aanwezigheid van Salmonella in eindproduct’.

Het laboratorium bepaalt of Salmonella aan- dan wel afwezig is. Indien Salmonella is aangetoond dan is de uitslag ‘aanwezigheid van Salmonella in swabs’.

1. => Breng op een objectglas een druppel zoutoplossing (0,85% NaCl).

2. => Breng met een steriele entnaald een beetje materiaal van de te onderzoeken kolonie in de druppel zodat een troebeling ontstaat.

3. => Beweeg gedurende 30-60 seconden het objectglas heen-en-weer (druppel laten zwenken).

4. => Beoordeel het resultaat tegen een donkere achtergrond (met een vergrootglas). De aanwezigheid van klontjes in het preparaat duidt op auto-agglutinatie van de onderzochte stam. De stammen die auto-agglutinatie vertonen worden niet onderzocht met polyvalent O-serum.

Agglutineer van Salmonella-verdachte kolonies met polyvalent serum A t/m E of A t/m G; indien negatief vervolgen met polyvalent serum A t/m S.

1. => Breng op een objectglas een druppel antiserum.

2. => Breng met een steriele entnaald een beetje materiaal van de te onderzoeken kolonie in de druppel zodat een lichte troebeling ontstaat.

3. => Beweeg gedurende 30-60 seconden het objectglas heen-en-weer (druppel laten zwenken).

4. => Beoordeel het resultaat tegen een donkere achtergrond (met een vergrootglas). De aanwezigheid van klontjes in het preparaat duidt op een positieve reactie van de onderzochte stam.

Agglutineer van Salmonella-verdachte kolonies eerst met serum A t/m E of A t/m G; indien negatief vervolgen met polyvalent serum A t/m S.

Bij een positieve agglutinatie met polyvalent A t/m G wordt geagglutineerd met de groepssera B, C (C1 en C2), D en E (1 t/m 5).

Indien positief met B, dan wordt vervolgens geagglutineerd met flagellair antiserum H-i. Hiertoe wordt een schuine agar (bijvoorbeeld nutriëntenagar) beënt (middels ladderen) met de te agglutineren Salmonella en wordt 1 druppel fysiologisch zout (0,85% NaCl) aan deze buis toegevoegd. Na 24 ± 2 uur incuberen bij 37 ° C wordt cultuur van de vochtige schuine zijde genomen voor de agglutinatie met H-i serum.

Indien H-i positief dan heeft men een Salmonella typhimurium. Indien H-i negatief dan is het een Salmonella B groep.

Indien positief met D, dan wordt vervolgens geagglutineerd met flagellair antiserum H-m.

Indien H-m positief dan heeft men een Salmonella enteritidis.

Indien H-m negatief dan heeft men Salmonella D groep.

Salmonella die alleen met polyvalent A t/m S agglutineren, kunnen, indien gewenst, voor typering opgestuurd worden naar het RIVM, t.a.v. Infectieziekten, Diagnostiek en Screening laboratorium. Dit geldt tevens voor alle niet-serotypeerbare Salmonella.

1. a)

   Indien onvoldoende inlegvellen worden aangeleverd.

2. b)

   Indien de monsters inlegvellen onvoldoende groot zijn.

3. c)

   Indien de monsters inlegvellen niet duidelijk met mest zijn besmeurd.

4. d)

   Indien de monsters inlegvellen niet worden aangeleverd in een plastic monsterpot of -zak.

1. a)

   Indien het monster niet minimaal 25 gram dons bevat.

2. b)

   Indien het monster geen natte dons bevat.

3. c)

   Indien het monster niet in een monsterpot of -zak wordt aangeleverd.

Swabs:

1. a)

   Indien onvoldoende swabs worden aangeleverd.

2. b)

   Indien de swabs onvoldoende met mest zijn besmeurd.

3. c)

   Indien de swabs niet tot twee mengmonsters zijn gepoold (tenzij de swabs individueel zijn verpakt).

4. d)

   Indien de swabs niet in monsterpotten worden aangeleverd.

Overschoentjes:

1. a)

   Indien onvoldoende paar overschoentjes zijn aangeleverd.

2. b)

   Indien de overschoentjes niet duidelijk met mest zijn besmeurd.

3. c)

   Indien de overschoentjes niet in monsterzakken worden aangeleverd.

4. d)

   Indien elk paar overschoentjes niet in een aparte monsterzak is verpakt.

1. a)

   Indien onvoldoende blindedarm monsters zijn genomen.

2. b)

   Indien de blindedarm monsters van onvoldoende formaat zijn.

3. c)

   Indien de blindedarm monsters niet in kunststofbakjes zijn aangeleverd.

1. a)

   Indien het monster vel van de borstkap niet minimaal 25 gram weegt.

2. b)

   Indien het monster niet gekoeld ( 0 – 4 °C) getransporteerd en bewaard is.

1. a)

   Indien het monster eindproduct niet minimaal 25 gram weegt.

2. b)

   Indien het monster niet gekoeld ( 0 – 4 °C) getransporteerd en bewaard is.